飞蝗表皮脂形成关键基因的功能研究

发布时间：2020-04-12 02:24

【摘要】：昆虫表皮是其适应环境的保护性屏障,表皮脂是表皮的重要组成成分,可以避免昆虫体内水分蒸发和防止外源物质侵入。昆虫的生长发育离不开表皮周而复始的蜕去和形成,表皮脂的形成对维持表皮结构完整性至关重要。表皮脂形成关键基因的筛选及功能研究将揭示表皮脂形成的分子机制,具有重要的理论与实践意义。本文以飞蝗Locusta migratoria为研究对象,基于飞蝗转录组数据库搜索相关基因,利用RNAi技术(RNA interference,RNAi)结合相关检测方法,探讨脂合成和转运关键基因在飞蝗表皮脂形成过程中的生物学功能。主要研究结果如下:一、飞蝗乙酰辅酶A羧化酶(ACC)基因鉴定与功能研究乙酰辅酶A羧化酶是脂肪酸合成过程中的限速酶。基于飞蝗转录组数据库,搜索获得1条ACC基因序列。该基因编码的蛋白,其催化功能区包括生物素羧化酶(BC)、生物素羧基载体蛋白(BCCP)和羧基转移酶(CT)。飞蝗5龄期发育阶段RT-qPCR表达分析结果显示,LmACC在蜕皮后前3天表达量较高;组织表达分析结果显示,LmACC在脂肪体和体壁高表达;细胞组织定位结果显示,LmACC定位于脂肪体和绛色细胞;采用RNAi技术,有效沉默LmACC表达后发现,部分若虫出现蜕皮困难致死表型,而成功蜕皮至下一龄期的若虫则出现陆续死亡的表型;中性脂荧光染料Bodipy~(505/515)染色结果发现,脂类物质以脂滴形式主要分布在脂肪体中,与dsGFP-注射组若虫相比,dsLmACC-注射组若虫体内脂滴的荧光强度较弱,表明体内中性脂含量减少;表皮超微结构观察结果显示,抑制LmACC表达后,原表皮中孔道的物质含量与对照组相比无明显差异;采用气相色谱质谱联用仪(GC-MS)检测分析表皮碳氢化合物(cuticular hydrocarbon,CHC)含量,结果发现,dsLmACC-注射组若虫的CHC含量减少了38.8%。综上所述,LmACC参与飞蝗体内脂类物质合成,沉默该基因后影响表皮碳氢化合物的合成量。二、飞蝗细胞色素P450 CYP4G家族基因鉴定与功能研究细胞色素P450 CYP4G亚家族是昆虫特有且高度保守的基因。基于飞蝗转录组数据库,获得两条CYP4G基因cDNA序列,由P450国际命名委员会命名为LmCYP4G62和LmCYP4G102。LmCYP4Gs具有一系列细胞色素P450 CYP4G亚家族基因的特征序列和保守结构域。LmCYP4Gs在飞蝗5龄期发育阶段的表达结果表明,LmCYP4G62在5龄中期表达量较高,而LmCYP4G102在5龄期持续高表达。组织部位表达分析结果表明,LmCYP4G62和LmCYP4G102均在体壁高表达,脂肪体中次之,其他组织部位基本不表达;原位杂交结果发现,LmCYP4G62和LmCYP4G102均特异地存在于绛色细胞中。采用RNAi技术,有效沉默靶基因表达,结果发现,dsLmCYP4G62-注射组若虫均可成功蜕皮至下一龄期,能够正常生长发育;dsLmCYP4G102-注射组若虫在顺利蜕皮至下一龄期后,体重在短时间内迅速减轻,出现表皮皱缩易碎表型,死亡率为100%,而高湿环境可缓解该死亡表型;透射电镜结果显示,抑制LmCYP4G102表达后,原表皮中孔道的物质含量与对照组相比无明显差异;CHC含量检测结果显示,与对照组相比,dsLmCYP4G62-注射组若虫CHC含量无显著性差异,而dsLmCYP4G102-注射组若虫的CHC含量明显减少约83%。三、飞蝗ABC转运蛋白H家族基因分子特性与功能研究三磷酸腺苷结合盒(ATP-binding cassette,ABC)转运蛋白是一类重要的跨膜蛋白超家族,参与生物体内物质的转运过程。基于飞蝗转录组数据库,根据黑腹果蝇D.melanogaster和赤拟谷盗T.castaneum ABCH亚家族核苷酸序列进行同源序列搜索,获得3条基因序列,分别将其命名为LmABCH-9A,LmABCH-9B和LmABCH-9C;LmABCHs为半转运子蛋白,包含Walker A、Walker B和ABC特征基序C(LSGGQ)3个保守区域,在其C端均含有内质网保留信号KDEL。RT-qPCR表达分析结果显示,LmABCH-9A在5龄期持续高表达,LmABCH-9B和LmABCH-9C均在5龄第1天表达量最高,之后呈现下降趋势;组织分布结果显示,LmABCH-9A在所检测的组织中均有表达,其中在翅芽的表达量最高;LmABCH-9B和LmABCH-9C具有相似的组织表达模式,均在具有表皮结构的组织(如体壁)和触角中表达量较高。采用RNAi技术,有效沉默LmABCHs表达后观察发现,ds LmABCH-9A-和dsLmABCH-9B-注射组若虫均可正常生长发育,顺利蜕皮至下一龄期,无可见异常表型;而dsLmABCH-9C-注射组若虫在蜕皮至下一龄期时,部分若虫在蜕皮过程中死亡,大部分若虫在顺利蜕皮后,体重会在短时间内迅速减少,出现表皮皱缩现象,死亡率为100%,而高湿环境可以降低若虫的死亡率。表皮渗透性检测结果表明,沉默LmABCH-9C表达后,飞蝗表皮渗透性增强,外界物质可渗入表皮;透射电镜观察表皮结果发现,抑制LmABCH-9C表达后,与对照组相比,原表皮中孔道内物质含量减少,推测LmABCH-9C参与表皮脂类物质在孔道中的转运;采用GC-MS检测CHC含量,结果发现,与对照组相比,dsLmABCH-9C-注射组若虫CHC含量减少约63.3%。综上所述,本文研究发现,通过RNAi技术,高效抑制LmACC、LmCYP4G102和LmABCH-9C表达后,均会导致飞蝗蜕皮至下一龄期后的死亡表型。进一步采用中性脂染色方法,超微结构观察技术,以及气质联用仪检测CHC含量的方法,研究发现,飞蝗出现死亡表型的原因各有不同,LmACC作为脂肪酸合成的限速酶,主要参与飞蝗体内脂类物质的合成,为昆虫生长发育提供能量,沉默该基因后,飞蝗体内脂合成量减少,间接影响了CHC合成量;LmCYP4G102参与CHC的合成,该基因的沉默可导致表皮碳氢化合物含量显著降低,保水性能减弱;LmABCH-9C负责将表皮脂类物质通过孔道运输至上表皮层,抑制该基因表达后,脂类物质无法到达上表皮层和外包膜,表皮碳氢化合物的含量减少,导致表皮保水性能减弱。本文筛选获得了参与脂类合成的关键基因LmACC、参与表皮碳氢化合物合成的基因LmCYP4G102和参与表皮脂转运的基因LmABCH-9C,丰富了昆虫表皮脂的研究内容,为害虫绿色防控提供了新的分子靶标。
【图文】：

图 1-2 不同昆虫表皮中脂类各组成成分所占百分比[17]main groups of compounds occurring in the epicuticular wax shownof total wax in different insect species.质主要包括碳氢化合物、蜡、游离脂肪酸、醇、甘油三酯、甾

图 1-3 果蝇幼虫期绛色细胞的结构[28]Fig 1-3 Larval oenocytes in Drosophila melanogaster.虫侧面观，，体节 A1-A6 均匀分布 1 个绛色细胞簇（绿色）；（B）部位是气管。
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q963

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本文编号：2624156