人SH2B3基因敲除的方法建立和功能验证

发布时间：2020-04-12 13:49

【摘要】：红细胞是血液中主要的和含量最多的细胞,在氧气运输和免疫过程中起着的重要作用。目前,临床用血主要依赖于社会无偿献血,这种血液来源的渠道是不稳定的,而且还存在安全性问题。用干细胞向红细胞诱导的方法,在人胚胎干细胞和诱导性多能干细胞上有理论和实验基础,但是,因为诱导效率很低导致制备成本很高。此外,还存在伦理和安全性的问题,从而限制干细胞在红细胞诱导领域的进一步运用。人脐带来源的人脐带间充质干细胞,作为机体的成体干细胞,不存在伦理和安全性问题,是一种很好的初始细胞。研究显示敲除或抑制SH2B3基因的表达,可以提高干细胞向红细胞诱导的效率。本研究利用CRISPR/Cas9对目的细胞进行基因编辑,针对原代细胞的特点,设计了通过CRISPR/Cas9技术和双抗性双荧光基因介导同源重组插入敲除目的基因的策略,用于敲除人脐带间充质干细胞内的SH2B3基因,为建立一种高效率的将人成体干细胞诱导获得成熟红细胞的方法打基础。本研究结果如下:1.构建了敲除载体和同源重组筛选载体以pX330载体为骨架载体,构建了能够共表达具有核定位信号的Cas9蛋白和靶向SH2B3基因第五外显子的sgRNA的敲除载体pSH2B3-KO。利用多种分子克隆技术,完成了同源重组筛选载体pTGP多个元件的拼接。并进一步完成同源重组筛选载体pTMN、pTMP、pTEGP、pTEMN和pTEMP等的构建。2.CRISPR/Cas9技术介导的同源重组插入敲除体系的验证在人的293细胞中,初步证明了上述所构建的筛选载体能够正常工作,在荧光显微镜下,能观察到相应的荧光信号。然后,对共转染pSH2B3-KO和pTGP载体的293细胞进行了为期四周的药物筛选。分别在细胞水平和分子水平证明,CRISPR/Cas9技术和筛选基因介导的同源重组插入敲除SH2B3基因的方法是可行的。从而能够通过荧光信号或药物处理筛选出目的敲除类型的细胞,免去有限稀释分单克隆方法的繁琐和长耗时的实验操作。3.用CRISPR/Cas9技术敲除SH2B3基因用上述CRISPR/Cas9技术介导的同源重组插入敲除体系处理人HeLa细胞,加嘌呤霉素和新霉素筛筛选两周后,将细胞进行有限稀释法分离获得19株单克隆细胞。提取基因组DNA和总RNA进行PCR和RT-PCR鉴定分析。PCR结果显示,100%的细胞都检测到了筛选元件的插入。其中89.5%的细胞克隆双靶位点被破坏或插入筛选片段,57.9%的细胞克隆发生了双插入敲除,42.1%的发生单插入敲除。测序和RT-PCR检测的结果证明,筛选元件已经准确整合到基因组上,并能进一步在转录水平检测到筛选元件的整合。将同源重组插入敲除SH2B3基因的策略,初步运用到原代细胞人脐带间充质干细胞时,通过电转染法,电转染效率能达到30%左右。因为药物筛选后获得的转染细胞增殖能力不足,目前尚未在原代人脐带间充质干细胞上筛选建立SH2B3基因敲除细胞系。还需对人脐带间充质干细胞的药物筛选浓度及恢复条件进行优化。
【图文】：

示意图,序列,载体,实验步骤

3-1 敲除载体 pSH2B3-KO 和拼接位点序列示ting vector pSH2B3-KO and the targeted sit（实验步骤参考说明书）获得 293 细胞 DNA 为模板，进行巢式 PCR，，先通过引共 4 098 bp 的基因组 DNA 序列。以该上游臂（U, 5，臂, 1 449 bp）（图3-2A）；通m, 701 bp）产物（图 3-2B）。

电泳图,巢式PCR,产物,电泳

引物SH2B3-5’臂，PCR获得上游臂（U, 5，臂, 1 449 bp）（图3-2A）；通过引物SH2B3-3’arm，PCR 获得下游臂（D, 3’arm, 701 bp）产物（图 3-2B）。图 3-2 巢式 PCR 产物电泳。（A）上游臂；（B）下游臂Fig. 3-2 Electrophoresis of nested PCR products.（A）Upstream homologous arm;（B）Downstreamhomologous arm以载体 pcDNA-3.1 为模板，引物 CMV-bGH，通过 PCR 在 CMV-bGH 两端分别引入两个同方向的 loxP 位点，获得‘loxP-CMV-bGH-loxP’片段（C, 685 bp）（图 3-3）。图 3-3 PCR 产物‘C’琼脂糖凝胶电泳结果Fig. 3-3 Agarose gel electrophoresis results of the PCR products of DNA fragment ‘C’以载体 pCDH-gp 为模板，通过引物 copGFP-PuroR，PCR 获得‘copGFP-T2A-PuroR’片段（GP, 1 469 bp）（图 3-4）。图 3-4
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q78

【参考文献】