桑树耐旱关联microRNA及其靶基因鉴定与功能分析

发布时间：2020-04-12 16:52

【摘要】：MicroRNAs(miRNAs)是生物体内一类非编码小RNA分子,长度约为21-24个碱基,主要通过对靶基因mRNA的翻译抑制、降解等负调控的方式在转录后水平精确有效地调控基因的表达。植物miRNA能响应干旱、高盐、低温等非生物胁迫,在植物抗逆过程中发挥重要作用。各种逆境条件会对桑树的生长造成重大影响,研究桑树(Morus alba L.)一些重要的miRNA及其靶基因的功能和它们在胁迫条件下的生理生化、分子适应机制,对提高桑树的抗逆性、保存桑树种质资源和提高桑树产量有重要作用,同时为利用桑树作为生态林树种各方面的作用提供科学支撑。本研究通过高通量深度降解组测序技术系统全面的鉴定了桑树耐旱关联miRNA及其靶基因,通过瞬时转化及VIGS等方法对筛选出的关键miRNA及靶基因的抗旱功能进行了分析,探究了桑树耐旱的分子机制,主要的研究结果如下:一、利用高通量深度降解组测序技术鉴定桑树耐旱关联miRNA及其靶基因通过桑树深度高通量降解组测序,在对照文库(CL)中,分别鉴定出30个保守miRNA家族的409个靶基因和199个新miRNA的990个靶基因,在干旱文库(DL)中,分别鉴定出30个保守miRNA家族的373个靶基因和195个新miRNA的950个靶基因。DL保守miRNA家族中,miR156、miR172和miR396家族靶向最多数量的靶基因,推测这3个保守miRNA家族在桑树响应干旱胁迫中可能起到重要作用。通过分析miRNA-target分子网络图,我们发现在DL特有网络图中,有838个miRNA-mRNA pairs,占DL中总miRNA-mRNA pairs的63.34%。利用荧光定量PCR检测了11个靶基因和12个miRNA在干旱胁迫下的表达模式。通过RLM-5’RACE验证了6个靶基因的剪切位点,证明降解组测序得出的结果是非常准确的。GO注释和KEGG通路分析表明这些靶基因参加广泛的生物过程和各种代谢途径。二、桑树miR166f瞬时转化过表达鉴定其抗旱功能获得了桑树miR166f的前体序列,发现成熟体miR166f在前体的3’臂上,miR166f前体序列最小折叠自由能(MEFs)为-51.70 kcal/mol,具有典型的植物miRNA前体二级结构特征;miR166f 5’端上游除了包含典型的具有转录起始功能的TATA-box和CAAT-box外,还含有多个胁迫响应顺式作用元件和一些激素响应元件;建立了桑树miR166f瞬时转化体系,当转化液浓度OD_(600)为0.7、瞬时转化4 d时,叶片GUS组织化学染色效果最好,同时该处理条件下,叶片中GUS基因和miR166f的表达量与对照叶片中的表达量相比积累最显著,说明适宜浓度的转化液对瞬时转化效率有较大影响和农杆菌介导的瞬时转化有一定的时效性;在桑树中用不同浓度的转化液瞬时转化过表达miR166f后,与对照处理相比,miR166f的2个HD-Zip靶基因和1个JMJD6靶基因的表达水平均出现显著下降;同时叶片相对含水量(RWC)、可溶性蛋白含量、SOD活性、POD活性和Pro含量含量均出现不同程度的增加,而MDA含量显著降低。结果表明miR166f在桑树的抗逆境胁迫响应中发挥积极作用。三、桑树shabby-related蛋白激酶(MmSK)基因的克隆、表达分析及原核表达克隆获得包括完整ORF的MmSK基因(GenBank No:KY348867),其cDNA序列长为1705 bp,编码411个氨基酸残基,蛋白质分子质量为46.55 Kd,等电点为8.61。保守域结构分析表明,MmSK蛋白具有明显的蛋白激酶的结构域,属于植物类GSK3/shaggy蛋白激酶家族。通过多重序列比对和进化树分析发现,MmSK基因的氨基酸序列与其他比对间的同源性均在89%以上。实时荧光定量PCR分析表明,在桑树不同组织中MmSK基因的相对表达量有较大差异,暗示着MmSK可能参与了植物器官发育的调控,其中,MmSK在韧皮部中表达量最高。桑MmSK基因在高盐、干旱、低温和ABA处理等不同非生物胁迫处理下均上调表达,表明该基因参与了桑树的抗逆过程,为更好地了解MmSK基因在桑树响应逆境胁迫中发挥的作用及分子机制打下了基础。构建了鲁桑MmSK基因的原核表达载体pET-28a(+)-MmSK,并在大肠杆菌BL21中成功诱导表达重组蛋白MmSK。四、桑树VIGS体系的建立及MmSK基因抗旱功能鉴定利用八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)基因作为报告基因,构建桑树VIGS体系,并利用VIGS技术成功将桑树miR172的靶基因--MmSK基因沉默。MmSK基因沉默后,其在pTRV2-MmSK-VIGS植株的表达量仅为空载pTRV2-00阴性对照组植株的34.02%,差异极显著。在桑树中沉默MmSK基因后,叶片中可溶性蛋白含量、SOD活性、POD活性、Pro含量均出现不同程度的降低,而MDA的含量增加显著。在干旱胁迫下,随着干旱胁迫处理时间的延长,叶片中可溶性蛋白含量、Pro含量和MDA含量均逐渐增加,SOD活性和POD活性均呈现先上升后下降的趋势,在第5 d时,达到最大值,与MmSK基因表达量变化趋势一致。表明桑树MmSK基因沉默后,能引起桑树中一些与抗旱相关的酶类活性和代谢物的含量的降低,从而导致其抗旱性能减弱,进一步说明MmSK基因在桑树的干旱胁迫响应中发挥重要作用。本研究通过干旱胁迫桑树降解组高通量测序筛选桑树耐旱关联miRNA和靶基因,分析候选miRNA和靶基因的时空表达特性,通过瞬时转化过表达研究目标miR166f对靶基因表达的调控和对植株抗旱相关生理生化指标的影响;构建了桑树VIGS转化体系,并通过VIGS法鉴定MmSK基因的抗旱功能。研究结果完善了桑树抗旱的分子调控网络,为桑树抗逆机理研究及抗性品种选育提供重要的理论依据和探索途径。
【图文】：

植物,水分亏缺,干旱胁迫,细胞壁

图 1.1 干旱类型[10]Fig.1.1 Classification of drought1.1.1.2 干旱对植物的影响和危害干早对植物有非常广泛而深刻的影响和危害，会表现在萌发、营养和生殖生长等生长发育的各阶段及光合、呼吸作用、营养吸收和酶活力等具体的生理代谢过程[5,6]。植物受到缺水胁迫时，叶片和茎基幼嫩部会出现下垂的萎蔫现象。当干旱胁迫时间过长，植物由适应性萎蔫转为永久性萎蔫，就可能造成植物死亡。干旱对植物的影响和危害主要体现在以下几个方面。1.1.1.2.1 抑制植物生长发育水分亏缺能够改变细胞壁的伸展性能，如小麦、大豆、玉米等植物在水分亏缺下由于生长受到抑制，其细胞壁的伸展程度明显降低，胞壁物质在植物延伸生长中起到关键作用[13,14]。王晨阳[8]研究发现，土壤水分不足会抑制植株各茎节间活动，迟缓茎节生长，降低株高，随着干旱胁迫程度的加剧，各位叶的长度及叶面积减少，且其长/宽比值也减小。

示意图,植物生理,水分亏缺,示意图

江苏科技大学农学博士学位论文；干旱胁迫进一步加剧时，叶片水势下降到一定值后，光合速率大幅度下降旱胁迫的继续加剧，光合作用会部分或完全受到抑制，植物就会面临死亡。迫下，，叶绿素、核酸和蛋白质等大分子物质遭到破坏，生物膜结构被损伤，丧失，进而改变了植物一系列生理生化功能，这可能是导致光合活性降低的。干旱胁迫下叶绿体膨胀，排列紊乱，类囊体层肿胀或解体，光合器官的超微破坏[34]。干旱胁迫可导致烟株体内活性氧的积累、叶绿素含量下降，净光合，而呼吸速率则先升后降[35]。干旱缺水时会导致植物叶片气孔开度减小甚至，阻碍植物对 CO2的吸收，导致光合作用下降[36]。干早条件还会限制很多光过程。水分亏缺导致细胞内过多地积累活性氧，引发膜脂过氧化自由基链式使生物膜结构遭到破坏[25]。
【学位授予单位】：江苏科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S888.2

【参考文献】