灵芝细胞中参与灵芝酸生物合成细胞色素P450基因的筛选与分析

发布时间：2020-04-12 17:27

【摘要】：灵芝酸是一种灵芝生产的高度氧化的羊毛甾醇类衍生物,它具有抗癌、抗HIV等重要的药理学活性。目前灵芝酸生物合成途径仍未完全清楚,尤其是从中间代谢产物羊毛甾醇骨架修饰到形成灵芝酸的过程。研究表明,细胞色素P450可能参与了羊毛甾醇的修饰过程。目前仅发现cyp5150l8参与羊毛甾醇骨架C-26位羧基的形成,而其它相关的P450基因仍未清楚。本文首先研究了灵芝在灵芝酸高产/低产(液体静置/振荡)培养条件下的差异表达基因,发现共有3321个基因表达上调。对上调基因进行分析发现含有可能与类固醇结合的CYP512和CYP5144家族P450基因,结合文献分析,我们从中筛选出了10个与羊毛甾醇合酶基因lss表达正相关的CYP512和CYP5144家族P450基因。通过荧光定量PCR分析了所获得的10个P450基因在灵芝液体静置/振荡培养方式下的表达量,结果表明5个P450基因cyp512a3,cyp512a11,cyp5144n1,cyp512u4和cyp512v2在液体静置培养条件下的表达量分别是振荡培养条件下表达量的7.2,3.7,3.4,89.8和63.4倍。我们分析了这5个P450基因在液体静置/振荡动态培养条件下的表达量与灵芝酸T积累的相关性,发现cyp512v2和cyp512a3的表达量与灵芝酸T的含量正相关,相关系数分别为0.954和0.992,p值分别为0.046和0.008;进一步研究了这5个P450基因在不同培养(液体振荡、液体静置、静置钙离子添加、静置氮缺陷)方式下的表达量与灵芝酸T含量的相关性,结果显示cyp512v2的表达量与灵芝酸T的含量正相关,相关系数为0.992,p值为0.008。在灵芝细胞内对cyp512v2基因进行了基因沉默,获得了9株沉默菌株,基因组PCR验证结果表明沉默载体成功整合入沉默菌株中,荧光定量测定9株沉默菌株中cyp512v2基因的表达量分别被抑制了52%,75%,76%,27%,3%,36%,23%和49%。挑选了沉默效率较高的3株基因沉默菌株进行培养发酵,结果显示3株沉默菌株内灵芝酸T的含量分别比野生型菌株的含量降低了13%,69%和66%,结果暗示cyp512v2可能参与了灵芝酸T的生物合成。本研究获得了可能参与灵芝酸生物合成的候选P450基因cyp512v2,进一步通过酵母异源表达及在灵芝细胞内对cyp512v2基因进行缺失、回补等方法将明确其在灵芝酸生物合成途径中的作用。本研究对深入了解灵芝酸的生物合成和代谢调控具有重要的意义。
【图文】：

灵芝酸,生物合成途径

FPP 在鲨烯合酶 squalene synthase(SQS)的催化下单加氧酶的作用产生鲨烯 2, 3-氧化物，再经过羊毛甾甾醇。最后通过不同酶的修饰作用产生不同结构的灵通过同位素标记验证了羊毛甾醇可以转化为灵芝酸，步骤还是不清楚的，近年来相关的研究表明细胞色素后修饰（骨架的氧化和羟化）形成灵芝酸的过程[49-5径中有几个步骤是非常关键的，3-羟基-3-甲基戊二酰R)催化类异戊二烯生物合成的第一步反应，鲨烯合成成固醇和三萜的第一步酶反应，，羊毛甾醇合成酶(L酸的骨架结构羊毛甾醇。目前灵芝酸生物合成上游途酶，倍半萜合成酶 FPS 和鲨烯合成酶 SQS 和羊毛甾2]。

灵芝酸,培养条件,静置培养,液体

液体静 8.45 g/荡培养 T 含量静置培养条/L (干重，养下，分别为量是液体振荡条件和液体振DW)。灵芝为 254.67 和荡培养条件振荡培养条芝酸 T 的含15.76 μg/件下的 17 倍条件下细胞量含量在液体静/100 mg DW倍。昆明量无显著性静置培养条W。液体静明理工大学硕士性差别，分别条件下远远高静置培养条件士学别高件
【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S567.31;TQ920.1

【参考文献】