南极鱼Dm-SEPP基因cDNA结构和功能分析及对低温响应机制初探

发布时间：2020-04-12 20:46

【摘要】：对生活在极端寒冷环境下的鱼类而言,一个极其重要的问题就是如何避免受到寒冷环境的伤害。南极鱼鱼类之所以能在南极极端寒冷环境下生存,并成为南极海域主要的鱼类物种,其原因非常值得探究。我们先前使用转录组和比较基因组学分析研究发现:在南极鱼(Dissostichus mawsoni,D.mawsoni)鱼类进化发育中selenoprotein P的基因拷贝数发生了显著扩增,表明南极鱼selenoprotein P(Dm-SEPP)有助于南极鱼在极端寒冷环境中的生存,但是该基因的结构和功能未知。本研究对从南极鱼D.mawsoni c DNA文库中克隆得到的南极鱼Dm-SEPP基因进行c DNA结构和功能分析,并探究了其在低温下的响应机制。具体结果如下:(1)使用SECISearch3预测,在其3’-UTR区中存在两个SECIS元件,分别是1427-1502 bp和2001-2074 bp;计算得其等电点PI为5.68,分子量为40.96k Da;该序列在ORF区包含17个硒半胱氨酸U,硒半胱氨酸密码子的模式为UXU或UXUXU,U代表硒半胱氨酸,X代表任意氨基酸。将南极鱼、斑马鱼及哺乳动物人类的SEPP的m RNA结构及发夹结构比对,结果发现:这三个物种的SEPP中SECIS元件具有保守性,且其m RNA发夹结构具有共同模式:AUGA_AA_GA。(2)将南极鱼与其他物种的SEPP氨基酸序列比对,发现南极鱼与河豚或尼罗罗非鱼的SEPP氨基酸相似度高达63%,大多数U是保守的,南极鱼Dm-SEPP包含17个U。在MEGA 5.05软件中使用UPGMA方法构建进化树,结果表明南极鱼Dm-SEPP与河豚的最接近,模式生物中斑马鱼的最接近于南极鱼的Dm-SEPP。(3)通过Xho I和临近Eco RI两个酶切位点将南极鱼Dm-SEPP的c DNA(包括ORF和3’-UTR)克隆入pcDNA3.1(-)载体中;为方便监测,在其cDNA终止密码子(TAG)前插入FLAG标签并进行种间密码子优化。将构建好的Dm-SEPP-FLAG重组质粒转染入人胚胎肾细胞HEK-293T中,然后对细胞进行低温28°C处理,Western Blot及RT-q PCR表明Dm-SEPP在HEK-293T细胞中成功表达,且低温处理下Dm-SEPP表达量增加;流式细胞仪监测及台盼蓝染色结果表明低温处理下过表达Dm-SEPP的HEK-293T细胞比对照组ROS显著降低且存活率明显升高。所以,南极鱼Dm-SEPP在低温下通过抑制ROS引起的损伤而保护细胞。(4)将斑马鱼成纤维细胞ZF4细胞进行低温18°C处理3,5,30天后,收集蛋白监测低温下ZF4细胞内源性Em-SEPP的表达,Western Blot及RT-q PCR结果均表明:低温短期处理3天,Em-SEPP表达量明显增加;通过构建sh RNA慢病毒质粒对ZF4细胞进行内源性Em-SEPP敲降,低温18°C处理24小时后,监测其ROS及细胞存活率,结果表明:ZF4细胞内源性Em-SEPP敲降后ROS升高,存活率降低,且低温处理后ROS升高得更明显,细胞存活率降低得更明显。总而言之,本研究通过在293T细胞中过表达南极鱼Dm-SEPP探究其在南极鱼寒冷适应中的作用;为揭示其在鱼类寒冷适应中的作用,以斑马鱼ZF4细胞为例,研究发现低温能诱导ZF4细胞中Em-SEPP表达增高,ZF4细胞中内源性Em-SEPP敲降同时表明低温下SEPP通过调控ROS水平对细胞存活率造成影响,揭示了低温下SEPP表达增加对细胞存活的保护作用。这些数据表明硒蛋白SEPP的表达也许是低温下鱼类存活的一个普遍的保护机制。
【图文】：

南大洋及南极环流Fig.1.1TheSouthernOceananditsoceanographiccurrentsystemsurroundingAntarctica.

图 1.2 鲈形类亚目的进化分布Fig. 1.2 Phylogenetic distribution of the perciform suborderNotothenioidei.期寒冷水域中的生存适应性变化
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4

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本文编号：2625159