果蝇睾丸基因敲除突变休的构建及雄性生殖相关表型分析

发布时间：2020-04-13 10:20

【摘要】：雄性生殖系统的发育和功能的维持依赖许多基因的协同作用。这些基因在雄性生殖系统中表达并发挥功能,它们的突变可能影响睾丸的发育及精子的成熟,并最终导致育性的变化。随着生殖生物学研究的进展,已有很多基因功能得到深入研究但仍有许多基因的具体功能和作用机制未知。对这些基因功能的研究有助于人们了解精子发生机制并为诊断和治疗不育症提供理论基础。近年来,随着CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9(CRISPR-associated protein 9)基因编辑技术的成熟,简捷、高效、精准的基因编辑在越来越多的生物体中得以实施,其中就包括黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)这一经典的基因功能研究模型。利用CRISPR/Cas9技术结合同源定向修复(Homology Directed Repair,HDR)策略对果蝇基因组进行编辑,可以根据设计敲除目的基因或引入分子修饰。为研究果蝇睾丸基因在雄性生殖中的功能,本研究利用CRISPR/Cas9技术结合HDR在果蝇中对候选基因逐一进行敲除,建立纯合的突变果蝇品系,并对获得的突变体进行生殖表型的初步分析,以期望进一步开展基因相关功能的研究。我们依据数据库信息,按照睾丸中表达、与人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)基因高度同源、雄性生殖方面功能尚未见报道这三个标准进行了筛选,最终确定8个候选基因(CG4161、CG11475、CG2921、CG10541、CG7276、CG3800、CG8117和CG16779)进行研究。首先,我们通过RT-PCR对这些基因在果蝇和小鼠不同组织中的表达水平进行了检测,对数据库中的结果进行了验证。其次,针对这些基因的结构和序列,分别设计构建sgRNA质粒及带有红色荧光标记的供体模板质粒,利用显微注射导入表达有Cas9蛋白的果蝇胚胎中,通过对后代进行荧光标记筛选,得到基因敲除候选果蝇,并对候选果蝇进行了分子鉴定,最终获得纯合突变体品系。再次,为检测这些基因在雄性生殖中的作用,我们对8个敲除品系的雄蝇进行了生育力测试,结果显示CG3800~(-/-)和CG7276~(-/-)雄蝇部分不育,且可育果蝇后代数量较野生型显著下降,而其它基因敲除突变体育性正常,后代数量与野生型无显著差异。最后,我们还对这些突变体进行了细胞学分析。睾丸解剖观察显示CG3800~(-/-)和CG7276~(-/-)不育雄蝇出现不同程度精囊缩小、精原干细胞减少和细胞分布混乱,而其他突变体雄蝇成熟精子数量充足。染色结果也提示部分CG3800~(-/-)和CG7276~(-/-)雄蝇出现个性化复合体(individualization complex,IC)不同步及精子散乱等现象。这些突变体的获得及表型的初步分析为进一步研究基因功能及机制提供了良好的动物模型及基础。
【图文】：

质粒图谱,生物科技,载体,同序

21图 1-1 No.92 pGX-attP-DsRed 质粒图谱5’和 3’同源臂分别与目的基因 5’切割位点和 3’切割位点相接，以野生型果 w1118基因组 DNA 为模板，PCR 扩增长度约 2.4kb 的同源臂片段，5’和 3’片段分别添加 20bp 包含 EcoRI 和 NheI 及 SpeI 和 XhoI 酶切位点的与载体一致的同序列，使用单片段同源重组试剂盒（诺维赞生物科技有限公司，南京），将 5’源臂连接到用限制性内切酶 EcoRI、NheI（New England Biolabs，美国）酶切载体上，获得的质粒测序正确后再用 SpeI 和 XhoI 双酶切，与 3’同源臂连接，，序正确后得到供体 DNA 质粒（图 1-2）。

CG4161供体质粒构建示意图
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q492;Q78

【参考文献】