文昌鱼胚胎发育中Fused基因功能研究及2A肽介导共表达载体构建

发布时间：2020-04-14 07:45

【摘要】：Fused基因在动物胚胎Hedgehog(Hh)信号通路和纤毛发生过程中有着重要作用,Fused基因最早在果蝇体节中发现,参与果蝇胚胎发育中前后轴的区段体节极性的建立,并参与到果蝇Hedgehog(Hh)信号通路,而随后在小鼠和斑马鱼研究中发现Fused具有参与运动纤毛中央对的建立的功能。虽然Fused功能在无脊椎动物和脊椎动物中被广泛报道,但是Fused基因表达谱以及功能分析在文昌鱼胚胎发育中都没有任何研究。本文先通过原位杂交和实时定量PCR对Fueed基因在不同时期的空间表达谱进行系统的研究,随后利用基因过表达和敲除2种方法研究文昌鱼Fused基因与胚胎发育中Hedgehog(Hh)信号通路的关系。原位杂交及实时定量PCR结果显示,Fused基因为母源性表达,并且在胚胎发育早期呈现全胚胎表达模式,随着胚胎发育到3体节时期,Fused基因开始集中表达在文昌鱼胚胎内胚层。在过表达实验中,注射Fused全长mRNA后并没有观察到任何胚胎发育异常的现象,并且原位杂交检测文昌鱼中Hh信号通路下游靶基因Ptch表达也未发生变化。对于这个结果可能是Fused激酶在Hh信号通路中参与suppressor of Fused(Sufu)磷酸化从而促进Gli入核,而过量的Fused并不能使得suppressorofFused(Sufu)磷酸化增加,因此Gli入核程度变化不大,未能检测到Hh信号通路上调的结果。本文筛选出已敲除Fused基因文昌鱼F1,将相同移码突变个体(缺失4bp)进行自交,成功获得含有Fused纯合突变的F2代。原位杂交检测F2后代胚胎发现,在自交后代中有四分之一胚胎出现Fused基因表达消失现象,这暗示着我们获得Fused基因敲除的文昌鱼,而Hh信号通路下游靶基因Ptch在Fused-/-中却没有发生明显变化,说明Fused基因可能没有参与文昌鱼Hh通路。F2幼体个体基因型鉴定结果发现后代中Fused+/+:Fuse+/-:Fused/-=l:2:1,符合孟德尔分离比,但是光学显微镜下观察的Fused-/-个体却没有表现出和文昌鱼Hh信号通路其他功能元件敲除突变体相类似的表型(如脑泡,眼点,口,尾部器官变化的表型)。在随后观察中我们发现Fused-/-在胚后发育比相同培养条件下的Fuse+/+,Fused+/-缓慢,并且Fused/-在受精后3星期内全部死亡。以上结果表明文昌鱼Fused并没有参与到Hh信号通路调控中去,但是Fused基因在文昌鱼胚后3周正常发育中起到作用。为了确认Fused基因是否参与文昌鱼运动纤毛发生,我们通过免疫荧光和扫描电镜对Fused/-中运动纤毛分布和长度进行细致的观察。结果显示,Fused/-中运动纤毛的分布和长度与野生型并没有显著性差别。考虑到Fused基因为母源性表达,母源性残余的Fused蛋白可能对运动纤毛发生起相应作用,所以我们通过高盐处理脱去Fused-/-3体节期、8体节期、12体节期运动纤毛,并用扫描电镜检测运动纤毛在Fused-/-中再生的情况。但是扫描电镜结果显示,Fused/-中运动纤毛再生的情况与野生型中没有显著性差别。随后我们在光学显微镜下对幼体Fused--中运动纤毛的摆动进行观察,也未发现与野生型有明显区别。由上述结果我们推测Fused基因并未参与文昌鱼中运动纤毛发生和功能发挥。2A肽介导的多基因表达载体具有高裂解活性、上下游基因等摩尔表达等优点,已广泛应用于动物转基因研究。文昌鱼作为一种新兴的模式动物,尚无应用这种表达载体的报道,但已有的pCS2转录系统在文昌鱼中表达效率不高,我们在pXT7转录系统重新构建一个由P2A(一种2A肽)介导的多基因表达载体。将体外转录的mRNA注入文昌鱼胚胎后,经过激光共聚焦显微镜检测表明,由P2A介导的mRNA在文昌鱼原肠胚中期即开始表达,并且随着胚胎发育表达量不断上升。在胚胎发育至5体节期时我们能明显观察到eGFP蛋白被定位到细胞核中,而mCherry蛋白被定位到细胞膜上,说明此时重组eGFP蛋白和mCherry蛋白已被完全剪切开。通过蛋白质免疫印迹检测表明,在8体节时期由P2A介导的mRNA在文昌鱼胚胎中剪切效率达到了 91%,说明2A肽介导的多基因表达载体在文昌鱼胚胎中具有高效的翻译和剪切效率。进而我们构建了由文昌鱼热启动子(BbHsp70)启动的P2A多基因共表达载体,热激证明其也能在文昌鱼胚胎中表达,并且能被剪切成两个独立的蛋白,达到了预期的效果。综上,我们成功地构建了一个在文昌鱼中可用热激启动表达、由P2A介导的多基因表达载体。
【图文】：

信号通路,同源基因,纤毛,实线

图１－１不同模式动物中纤毛，Ｆｕｓｅｄ／Ｃｏｓ２，Ｈｈ信号通路的关系总结（引自Ｒｉｎｋ，２００９［＇１２］）逡逑Ｋｉｆ２７／ＩＣｉｆ７是Ｃｏｓ２的同源基因，图中虚线表示尚未证实的推测结果，实线表示己得到逡逑．验证的结缉。逡逑Ｆｉｇ邋１－１邋Ｓｕｍｍａｒｙ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ｃｉｌｉａ，，邋Ｆｕｓｅｄ邋ａｎｄ邋Ｈｈ邋ｓｉｇｎａｌｉｎｇ邋ｐａｔｈｗａｙ邋ｉｎ逡逑ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ａｎｉｍａｌ邋ｍｏｄｅｌ邋ｓｙｓｔｅｍｓ逡逑Ｋｉｆ２７／Ｋｉｆ７邋ｉｓ邋ｔｈｅ邋ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｇｅｎｅ邋ｏｆ邋Ｃｏｓ２．邋Ｔｈｅ邋ｄｏｔｔｅｄ邋ｌｉｎｅ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｇｒａｐｈ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｓ邋ｔｈａｔ邋ｔｈｅ逡逑ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｈａｖｅ邋ｎｏｔ邋ｂｅｅｎ邋ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ，邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｓｏｌｉｄ邋ｌｉｎｅ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｓ邋ｔｈａｔ邋ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｈａｖｅ邋ｂｅｅｎ邋ｖｅｒｉｆｉｅｄ逡逑三２Ａ肽（Ｐ２Ａ）在多基因共表达的研究进展逡逑１邋２Ａ肽的起源逡逑２Ａ肽于１９９１年在口蹄疫病毒（ＦＭＤＶ）中发现，是－？种２０个左右氨基酸逡逑组成可以自裂解为小片段肽。在ＦＭＤＶ中，２Ａ肽的剪切通过核糖体跳跃将自己逡逑的Ｃ－端自动裂解，同时Ｎ－端被３Ｃ／３ＣＤ蛋白酶裂解后来的研究中发现，其逡逑

自剪切,机制,口蹄疫病毒,多基因

Ｈｈ邋ｐａｔｈｗａｙ逡逑Ｆｕ＆ｅｄ逡逑图１－１不同模式动物中纤毛，Ｆｕｓｅｄ／Ｃｏｓ２，Ｈｈ信号通路的关系总结（引自Ｒｉｎｋ，２００９［＇１２］）逡逑Ｋｉｆ２７／ＩＣｉｆ７是Ｃｏｓ２的同源基因，图中虚线表示尚未证实的推测结果，实线表示己得到逡逑．验证的结缉。逡逑Ｆｉｇ邋１－１邋Ｓｕｍｍａｒｙ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ｃｉｌｉａ，邋Ｆｕｓｅｄ邋ａｎｄ邋Ｈｈ邋ｓｉｇｎａｌｉｎｇ邋ｐａｔｈｗａｙ邋ｉｎ逡逑ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ａｎｉｍａｌ邋ｍｏｄｅｌ邋ｓｙｓｔｅｍｓ逡逑Ｋｉｆ２７／Ｋｉｆ７邋ｉｓ邋ｔｈｅ邋ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｇｅｎｅ邋ｏｆ邋Ｃｏｓ２．邋Ｔｈｅ邋ｄｏｔｔｅｄ邋ｌｉｎｅ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｇｒａｐｈ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｓ邋ｔｈａｔ邋ｔｈｅ逡逑ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｈａｖｅ邋ｎｏｔ邋ｂｅｅｎ邋ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ，邋ａｎｄ邋ｔｈｅ邋ｓｏｌｉｄ邋ｌｉｎｅ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｓ邋ｔｈａｔ邋ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｈａｖｅ邋ｂｅｅｎ邋ｖｅｒｉｆｉｅｄ逡逑三２Ａ肽（Ｐ２Ａ）在多基因共表达的研究进展逡逑１邋２Ａ肽的起源逡逑２Ａ肽于１９９１年在口蹄疫病毒（ＦＭＤＶ）中发现，是－？种２０个左右氨基酸逡逑组成可以自裂解为小片段肽。在ＦＭＤＶ中，２Ａ肽的剪切通过核糖体跳跃将自己逡逑的Ｃ－端自动裂解
【学位授予单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q78

【参考文献】