去泛素化酶USP22参与ERα介导的基因转录调控及其在血管钙化中的作用

发布时间：2020-04-17 11:55

【摘要】：目的:随着老龄人越来越多,血管钙化(vascular calcification,VC)发病率越来越高;VC,作为心血管疾病的并发症,增加其发病率和死亡率。临床研究表明,雌激素疗法明显降低冠状动脉钙化的发病率。一些实验研究显示,雌激素E2/雌激素受体α(ERα)通过影响COX2,RANKL,Gas6进而抑制VC。提示雌激素受体α(ERα)在VC中扮演着重要保护角色。ERα是核受体重要成员之一。去泛素化酶USP22是泛素蛋白酶系统的组成部分,也许在心血管疾病中发挥重要作用,但其机制未见报道。USP22作为核受体的辅调节因子,在前列腺癌中参与雄激素受体(AR)介导的基因转录调控。USP22是否参与ERα介导的基因转录调控未见报道。本研究目的建立人主动脉平滑肌细胞(hASMCs)钙化模型,证实USP22参与ERα介导的基因转录调控进而在血管钙化中发挥重要作用。方法:将hASMCs分别接种于正常DMEM培养基,含1.25Mmol/Lβ-磷酸甘油和0.625Mmol/L氯化钙(1.25Mm CAL)、2.5Mmol/Lβ-磷酸甘油和1.25Mmol/L氯化钙(2.5Mm CAL)、5Mmol/Lβ-磷酸甘油和2.5Mmol/L氯化钙(5Mm CAL)的钙化DMEM培养基中培养0、3、7、9天。用1%/2%Alizarin-red S染料染色,在倒置相差显微镜下成像;在5Mm CAL条件下培养0,3,7,9天,Western blot实验检测钙化相关蛋白BMP2,RANKL,COX2,Gas6,ERα的表达。荧光素酶双基因报告实验检测在hASMCs中,去泛素化酶USP22是否参与ERα介导的基因转录调控;过表达USP22,Western blot实验检测钙化相关因子BMP2,RANKL,COX2,Gas6,ERα的蛋白表达。结果:在1.25Mm CAL DMEM培养条件下第9天hASMCs有明显的钙沉积;在2.5Mm CAL、5Mm CAL DMEM培养条件下第7天hASMCs出现钙沉积,第9天有明显钙沉积。hASMCs在5Mm CAL DMEM培养条件下,BMP2蛋白表达增加,提示平滑肌细胞表型向成骨表型转变;去泛素化酶USP22蛋白表达增加,提示USP22可能促进hASMCs钙化。荧光素酶双基因报告及过表达USP22后western blot实验结果显示USP22抑制ERα介导的下游基因Gas6转录调控进而促进hASMCs钙化。结论:在5Mm CAL浓度培养的条件下,平滑肌细胞表型向成骨表型转变;去泛素化酶USP22蛋白表达增加,可知USP22可能推动了血管钙化(VC)的进程。USP22抑制ERα介导的下游基因Gas6的转录,进而促进人主动脉平滑肌细胞(hASMCs)钙化。
【图文】：

相差显微镜,浓度梯度,程度,橘红色

3 实验结果.1 人主动脉平滑肌细胞钙化模型建立将 hASMCs 分别接种于正常 DMEM（0Mm CAL），含 1.25Mmol/Lβ-磷酸甘 0.625Mmol/L 氯化钙（1.25Mm CAL）DMEM、 2.5Mmol/Lβ-磷酸甘油.25Mmol/L 氯化钙（2.5Mm CAL）DMEM、5Mmol/Lβ-磷酸甘油和 2.5Mmol/L钙（5Mm CAL）钙化 DMEM 培养基中，培养 0、3、7、9 天。 0Mm CAL 为组，0、3、7、9 天染色，没有橘红色出现，即没有钙沉积出现；1.25Mm CAL DME养条件下，0、3、7 天没有染成橘红色，即没有钙沉积出现，9 天出现明显橘，即出现明显钙沉积；2.5Mm CAL、5Mm CAL DMEM 培养条件下，0、3 天钙沉积出现（没有染成橘红色），第 7 天出现少量钙沉积，第 9 天出现明显钙。结果如图 3.1。

相差显微镜,情况,橘红色,染料

图 3.2. 倒置相差显微镜高倍镜下观察 hASMCs 钙化情况（X100）用含 5Mm CAL 的 DMEM 培养基培养 hASMCs ，培养 9 天，分别用1%Alizarin-red S 和 2% Alizarin-red S 染料染色，倒置相差显微镜成像，染成橘红色为钙沉积；根据染色结果提示，1%Alizarin-red S 为最佳 hASMCs 钙化染色浓度，，结果图 3.3。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R54

【参考文献】