转vp28基因蓝藻防治日本沼虾WSSV的有效性和安全性

发布时间：2020-04-17 14:44

【摘要】：白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)已经鉴定到它可感染40种虾,39种蟹,涉及25个国家之多,已成为全球养虾业中蔓延最广、传播最快、死亡率最高的病毒。日本沼虾养殖分布广泛、常年可有,但对WSSV易感性及其防治报道极少。本文将转WSSV-vp28基因的蓝藻(Anabaena sp.PCC7120)制剂,用于日本沼虾口服,探讨日本沼虾与WSSV的感染关系,研究转基因蓝藻对日本沼虾的免疫保护效果,并探讨如何防止转基因蓝藻在制药过程中向环境释放,以保证抗WSSV蓝藻口服剂能够安全、有效的用于水产养殖业。结果主要如下:(1)用流行病学调查、不同途径感染试验等方法显示,日本沼虾是WSSV的自然宿主,自然携带率约为8.33%。日本沼虾可以通过注射、摄食、浸泡途径感染WSSV,10 d内累计感染率均为100%,累计死亡率分别为100%、75%和0%。其中注射途径感染日本沼虾,感染后5 d肌肉病毒含量达到感染后1 d的1 000倍,8 d死亡率达100%。用注射WSSV感染日本沼虾死亡率来测量病毒致死日本沼虾的半致死剂量(LD50),2.71×105病毒粒子/μL能使日本沼虾死亡率达到50%以上,此浓度高于南美白对虾半致死浓度。在养殖生产中,日本沼虾可以通过摄食感染WSSV的病虾或死虾而感染WSSV,也能通过浸泡在含WSSV的水体中而感染,并因此成为一种传播媒介,从而影响了 WSSV的迅速传播与致病。(2)日本沼虾经转vp28蓝藻口服剂免疫7d后,投喂感染WSSV的日本沼虾肌肉组织进行攻毒。攻毒第10d后,阳性对照、野生型、空载体累计死亡率分别高达81.25%、61.5%、87.5%,免疫组1死亡率为56.25%,而免疫组2死亡率仅为37.5%。相比于阳性对照组免疫组1、2存活率分别提高了 25%、43.75%。qPCR检测攻毒后第4d日本沼虾的鳃、肝胰腺、尾部肌肉各组织中WSSV含量显示,各组沼虾体内均能检测到WSSV,阳性、野生型、空载体三组对照各组织WSSV含量无差异,免疫组WSSV含量明显低于对照组;与对照组相比,免疫组1的鳃、肝胰腺、肌肉中WSSV含量均降低了 102倍,免疫组2的鳃、肝胰腺中WSSV分别降低了 104倍、103倍,肌肉中含量低于102copies/mg;攻毒后,三组对照组的鳃和肝胰腺细胞都出现大量细胞破裂、坏死、细胞核脱落等WSSV病灶症状;免疫组1的鳃、肝胰腺组织细胞部分出现了病灶现象,组织健康明显优于攻毒对照组;而免疫组2的鳃和肝胰腺组织细胞基本未发生病理现象。各组肌肉组织细胞,未发现WSSV病理现象。转vp28蓝藻口服剂处理日本沼虾后,提高了沼虾抵抗WSSV的免疫力,减少了 WSSV在体内的增殖,有效保护了日本沼虾的鳃、肝胰腺等组织,从而提高了日本沼虾的存活率。(3)制备转基因药物的前提是其安全性,这种安全性包括对人和环境两方面。对我们构建的转基因蓝藻,由于未进入食物链,环境释放影响自然界生态平衡更重要。用pH法处理转基因蓝藻后,在不同时间、温度和光照下观察效果,并用响应面法优化处理条件。最佳处理条件为:pH≤2.5、t≥50min、T≥30 ℃或pH≥12、t≥120 min、T≥30℃,杀藻率为100%。两个优化组合分别为:pH2.12、温度29.96℃、时间33.9 min或pH 12.33温度31.75 ℃、时间96.8 min。pH处理后的转基因蓝藻在平板上不能再继续生长。pH法对转基因蓝藻的杀藻率可达100%,有效防止了转基因蓝藻在制备对虾口服剂过程中向环境释放。上述结果首次证明了日本沼虾对WSSV的易感性低于南美白对虾,意味着日本沼虾可能含有内源的抗WSSV机制,也显示这种虾在WSSV感染区有推广价值。通过宏观死亡率及微观病毒含量和病理切片证明了转vp28蓝藻口服剂对日本沼虾有免疫效果,可用于此虾的WSSV防治。另外,本研究创立的pH法可有效防止转基因蓝藻在制备抗WSSV 口服剂过程中发生环境释,保证了本口服药的安全生产。
【图文】：

沼虾,死亡数,日本沼虾

上海海洋大学硕士＇学位论文逡逑２－１）邋＾通过提取死亡及未死亡ｇ本沼虾ＮＤＡ，进行ＰＣＲ及电泳实验后表明未逡逑死亡日本沼虾也己经感染ＷＳＳＶ邋（图２－２）邋＾实验结果表明，日本招虾可以通过逡逑摄食感染ＷＳＳＶ的病虾或死虾而感染ＷＳＳＶ。逡逑２．３日本沼虾注射感染ＷＳＳＶ逡逑定量注射ＷＳＳＶ病毒液后，２４邋ｈ后日本沼虾就出现了食欲减退状况，４８邋ｈ逡逑后几乎不进行摄食，以及出现反应迟钝、头胸部肿胀等症状，随后又出现了部分逡逑脱落症状，而且日本沼虾感染后至死亡和Ｒ服感染一样也一直未出现白斑症状。逡逑在感染４８邋ｈ后出现了少量死亡７邋７２邋ｈ时出现大量死亡，：９６邋ｈ时累计死亡量超过逡逑５０％，随后死亡速度下降，，１９２邋ｈ时累计死亡率为１００％，另外两个阴性对照组至逡逑实验结束分别死亡２尾和４尾（图２－３）逦取日本沼虾的肌肉组织进行定量ＰＣＲ逡逑检测表明，感染病毒２４邋ｈ后肌肉组织中的ＷＳＳＶ含量随着时间增加急剧增加，逡逑９６邋ｈ后增长减缓，１２０邋ｈ濒死的日本沼虾肌肉内ＷＳＳＶ含量是感染１２邋ｈ时肌肉含逡逑量的１邋０００倍。研宄结果表明

沼虾,粒子,死亡率,病毒粒子

通过将提纯并测定浓度的ＷＳＳＶ进行梯度稀释，然后对日本沼虾进ｆｉ１注射逡逑感染，结果显示，在１０Ｇ－１０２稀释组的死亡率为１００％，１０３稀释组为５７．１％，ｇ逡逑稀释１0４倍时死亡率低于５０％邋Ｃ图２－５）。另外，高浓度病毒液都能引起日本沼逡逑虾１００％的死亡，并随着病毒液的稀释，死亡率开始下降，并且各组死亡率依次逡逑降低。由此，可以计算出病毒导致发病死亡的ＬＤ５ｑ为１．２６Ｘ１０５病毒粒子／叫。实逡逑验结果也意味着在攻毒实验中可以用１0２稀释度作为攻毒剂量《死亡率可达逡逑１００％，此时病毒浓度为：２．７１＞＜１0６病毒粒子／｜ｉＬ。逡逑１００逦－逦＿Ｂ＿１0０逦０逦＾逡逑，彐：逡逑６逦■邋＋ｉ0４逦／／／逡逑［一逡逑逦，逦｜逦，逦ｉ逦，逦ｉ逦
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S945.4

【共引文献】