葡萄糖氧化酶基因在毕赤酵母中的高效表达研究

发布时间：2020-04-18 07:05

【摘要】：葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,EC 1.1.3.4),简称GOD,是一种需氧脱氢酶,在氧气存在时它能专一有效地将β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸从而有效地将去除氧气,已发展为一种重要的工业酶制剂,广泛应用于医药、食品、发酵、化工、生物等领域。葡萄糖氧化酶主要存在于多种动物、植物、真菌和细菌中,但动植物中GOD含量少且有一定的局限性,而细菌产生的GOD量也较少,难以达到理想产量。目前工业上最主要的GOD生产菌株是黑曲霉和青霉,但黑曲霉和青霉生产GOD产量较低、且提取和纯化工艺繁杂,因此利用基因工程手段构建更加优良高产的GOD生产菌株一直是科研工作者们努力研究的方向。为获得高产量、高活性的葡萄糖氧化酶表达菌株,我们根据毕赤酵母中密码子的偏爱性对已有报导的GOD双突变基因T132S/T56V进行DNA序列的密码子优化,并且在优化的基因序列前端引入45 bp的信号肽序列h_2-factor,通过人工基因合成的方法得到一个经过优化的葡萄糖氧化酶基因序列,命名为GOD-M,并将其克隆到表达载体pGAPk上,构建成为毕赤酵母重组表达质粒pGAPk-h_2-GOD-M。利用电击转化的方法将此重组质粒转化毕赤酵母GS115,利用GOD的酶学特性筛选酵母转化子,并验证到GOD基因的成功表达。为了找到能够得到更加高效的GOD表达载体,我们从启动子入手在重组载体pGAPk-h_2-GOD-M的基础上做以下改造:1.将质粒pGAPk-h_2-GOD-M的启动子pGAP替换成pGCW14,得到重组载体pGCW14k-h_2-GOD-M,编号G1;2.将质粒pGAPk-h_2-GOD-M的启动子pGAP替换成pAOX1,得到重组载体pAOX1k-h_2-GOD-M,编号A1;3.对质粒pGCW14k-h_2-GOD-M的启动子pGCW14进行定点改造,得到2种启动子发生了突变的重组载体,编号为MG1和MG2;4.对质粒pAOX1k-h_2-GOD-M的启动子pAOX1进行部分序列的改造,得到3种不同启动子的重组载体,分别编号为MA1、MA2和MA3;5.对启动子pGCW14和pAOX1的5’非编码序列(5’UTR)进行彼此互换,得到的重组启动子分别编号为GU_A和AU_G。以上所得表达载体转化毕赤酵母GS115,发酵培养测定发酵上清液的GOD酶活力,以此来比较各种启动子启动效率的强弱。通过酶活力测定,我们成功筛选到了能够更加高效表达GOD的组成型启动子pGCW14U_A和pGCW14G+20A/C-467T以及诱导型启动子pAOX1-DL*,有望在毕赤酵母高效表达研究中具有一定的前景。
【图文】：

西南大学硕士学位论文 载体构建GAP 质粒骨架大片段和 Kan 抗性基因片段扩增如如 3-2a 所示：通道 1 是 DN量标准；通道 2 和 3 分别是 PCR 产物 Kan 片段和 pGAP 质粒骨架大片段，量大小与预期相符，扩增成功。pGAPk 和 pMV-h2-GOD 的酶切鉴定如图 3：通道 1 是 DNA 分子量标准；通道 2 是 pMV-h2-GOD 质粒的酶切产物，有子量分别在 2200 bp 和 1700 bp 左右的条带，与预期相符，其中 1700 bp 左带为 h2-GOD 片段；通道 3 是 pMV-h2-GOD 质粒，其表观分子量小于实际值 bp；通道 4 是 pGAPk 质粒的酶切产物，与预期的 3217 bp 相符；通道 5 是 pGA，其表观分子量也小于实际值 3323 bp。通道 3 和通道 5 两个质粒表观分子际值偏小主要是因为其双链环状的分子结构。 pGAPk-h2-GOD 重组转化子筛选电泳如图 3-2c 所示，图中通道 M 为 DNA 分子量标准，1 、2、3、4、挑取的转化子质粒，7 为 pMV-h2-GOD 质粒。根据电泳结果选取分子量大小的 2、5 质粒送三博测序鉴定，测序结果正确，说明质粒构建成功。

2-GOD转化毕赤酵母，根据GOD基因是否在重组酵母中成功表达来验证所构建的GOD表达载体功能。酵母转化筛选结果如图3-4 ：平板上长出7个单菌落且都有GOD酶活力显示，，表明GOD表达载体成功转入了毕赤酵母并且实现了GOD在酵母中的表达，重组表达载体pGAPk-h2-GOD可以运用于后续毕赤酵母表达的研究中。图 3-4 酵母转化子筛选Fig. 3-4 Screening of Yeast transformation
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q786

【参考文献】

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本文编号：2631848