敲除SST基因增强胃癌细胞BGC823侵袭迁移能力及潜在胃癌驱动基因SEM5A和KLF2的表达

发布时间：2020-04-18 09:22

【摘要】：背景和目的生长抑素是一种肽类激素,由胃肠道黏膜的D细胞分泌,广泛存在于胃肠道粘膜,其中以胃窦和胃体部含量最高。有研究表明生长抑素在胃癌的发生发展过程中存在一定的抑制作用,也有学者发现不同浓度的SST可以刺激胃癌细胞的生长,因此,SST与胃癌的发生发展的关系及其作用机制和途径尚未明确。SST作为广泛分布在胃粘膜上的一种多肽类激素,可以抑制胃泌素的分泌从而诱导慢性萎缩性胃炎的发生,慢性萎缩性胃炎是胃癌发生的癌前疾病和病理基础。SEM5A和KLF2作为胃癌的潜在驱动基因,可能与SST在早期胃癌的发生发展存在着某种调控作用。过去对SST基因于胃癌的研究只局限与进行基因干扰或基因沉默,并未对SST基因进行真正意义上的敲除。尚未有文献报道SST发挥作用是否与胃癌驱动基因有关,因此我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对胃癌细胞的SST基因进行定点敲除,观察SST在胃癌发生过程中的作用和对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭等方面的影响,以及对胃癌驱动基因SEM5A和KLF2表达的影响,探讨SST是否通过调控胃癌驱动基因SEM5A和KLF2发挥抑制作用。方法1.针对SST基因靶位点设计sgRNA,在靶位点的上下游部位各设计一对sgRNA进行双切,根据sgRNA的位置设计reporter序列。序列合成后与载体px330和pmcherry EGFP进行酶切连接,构建重组载体px330-SST-sgRNA、pmcherry EGFP-SST-reporter,利用HEK293T细胞初步筛选出切割效率比较高的sgRNA。2.将重组载体转染到目的细胞BGC823,进行流式分选,培养获得单克隆细胞株。根据靶位点设计PCR引物,提取目的细胞基因组PCR后进行序列测定,鉴定单克隆细胞SST基因是否敲除成功。检测获得的目的细胞中是否有SST蛋白表达。3.敲除SST基因对胃癌细胞BGC823增殖、迁移和侵袭能力的影响。利用MTT实验检测细胞的增殖能力;Transwell实验检测细胞的侵袭能力;划痕实验检测细胞的迁移能力。4.敲除SST对胃癌驱动基因SEM5A和KLF2蛋白表达的影响。通过Western blotting和免疫细胞荧光检测SEM5A和KLF2的蛋白表达。结果1.成功构建载体px330-SST-sgRNA和pmcherry EGFP-SST-reporter,获得SST基因敲除的单克隆细胞株1E9。2.细胞的形态发生了变化,1E9细胞边界模糊,出现较多触角。细胞1E9的增殖能力增强,迁移和侵袭能力同时也增强。3.1E9细胞中胃癌驱动基因SEM5A和KLF2的蛋白表达量增强。结论SST在胃癌细胞BGC823的增殖、迁移和侵袭过程中发挥抑制作用,SST可能通过调控胃癌驱动基因SEM5A和KLF2抑制胃癌细胞的发生发展。
【图文】：

px330质粒图谱

敲除SST基因增强胃癌细胞BGC823侵袭迁移能力及潜在胃癌驱动基因SEM5A和KLF2的表达

pmcherryEGFP-reporter示意图
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.2

【参考文献】