玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因在拟南芥和烟草中的表达分析

发布时间：2020-04-18 11:20

【摘要】：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶pepc基因是C_4途径中的关键酶基因。为探究pepc基因对C_3植物拟南芥光合特性的影响,本实验以转玉米C_4型pepc基因拟南芥和野生型拟南芥为材料,对17个T_3代纯合pepc转基因拟南芥株系进行分子生物学鉴定,利用实时荧光定量PCR对pepc基因在转基因拟南芥中的表达及表达量进行测定。在现蕾期对pepc转基因拟南芥株系和野生型植株相应光合酶活性、叶绿素含量、叶绿素荧光、净光合速率等生理生化特征进行检测。并在干旱胁迫条件下测定pepc转基因拟南芥的抗氧化酶活性、可溶性蛋白、可溶性糖等生理特性。对玉米C_4光合途径关键酶基因pepc基因对C_3植物拟南芥光合特性影响效应进行了研究,主要研究结果如下:(1)对T_2代转pepc基因拟南芥转化植株进行筛选,获得17个高表达T_3代纯合pepc转基因拟南芥株系。(2)对17个高表达T_3代纯合pepc转基因拟南芥株系进行PCR检测,结果显示pepc基因已成功转入拟南芥基因组中,分别提取T_3代纯合pepc转基因拟南芥株系和野生型拟南芥植株的RNA,反转录生成cDNA进行RT-PCR,pepc转基因拟南芥植株和阳性质粒DNA都能扩增出200bp的目的条带。利用实时荧光定量PCR对pepc基因在转基因拟南芥中的表达量进行测定,PC2、PC3、PC5、PC7、PC15、PC16、PC18株系的pepc基因相对表达量较PC17分别高13.60、12.23、11.57、10.34、2.20、3.70、6.34倍,达到显著水平。(3)在现蕾期对17个高表达T_3代纯合pepc转基因拟南芥株系和野生型植株进行生理生化特征检测,pepc转基因株系PC2、PC3、PC5、PC9转基因株系的PEPC平均酶活性分别为552.16、438.48、389.76、194.88U/g,较野生型拟南芥植株分别提高了34、27、24、12倍;PC2、PC3、PC5、PC11、PC12、PC13、PC18转基因株系的叶绿素含量较野生型拟南芥植株分别提高了53.17%、57.56%、44.88%、42.44%、49.27%、45.61%、47.07%;pepc转基因株系PC2、PC3、PC5、PC9、PC11、PC12株系的Rubisco平均酶活性较野生型拟南芥植株分别提高了24.07%、23.77%、24.27%、22.09%、22.33%、24%;PC2、PC3、PC5、PC7、PC9、PC11、PC12、PC13、PC18转基因株系的净光合速率较野生型拟南芥植株分别提高了51.85%、43.82%、41.41%、41.58%、36.77%、37.96%、38.97%、36.28%、34.08%,增幅达到显著水平。(4)探究了干旱胁迫条件下转pepc基因拟南生理特性的变化,结果发现,在干旱胁迫处理下,所有株系的SOD、POD、CAT抗氧化酶活性较正常条件下均有所提高;在干旱胁迫下PC1、PC2、PC4、PC8、PC12、PC13转基因株系的SOD酶活性为5.57、5.39、5.26、4.47、4.96、4.11U/mg(pro),SOD酶活性上升明显;PC1、PC2、PC4、PC8、PC12、PC13转基因株系的POD酶活性为12.7、12.84、11.89、10.54、10.32、9.88KU/mg(pro)/h,pepc转基因株系在干旱胁迫处理下POD酶活性均有提高,其中PC1显著高于其他转基因拟南芥植株。在正常条件和干旱处理下pepc转基因株系SOD酶活性都高于野生型拟南芥植株;PC1、PC2、PC4、PC8、PC12、PC13转基因株系在干旱胁迫条件下的CAT酶活性为1.41、1.38、1.34、1.27、1.25、1.19KU/mg(pro)/h,pepc转基因株系在干旱胁迫处理下CAT酶活性均有提高,其中PC1显著高于其他转基因拟南芥植株。在正常条件和干旱处理下pepc转基因株系CAT酶活性都高于野生型拟南芥植株。T_3代纯合pepc转基因拟南芥株系的可溶性糖和可溶性蛋白与野生型没有显著性差异,其丙二醛含量有所降低。(5)通过根癌农杆菌介导法将携带玉米C_4光合途径关键酶基因pepc的表达载体(pEXPR-PEPC)导入NC89型烟草幼嫩叶片中,经过愈伤组织和生根诱导获得再生植株,再生植株经过PCR和RT-PCR分子生物学鉴定结果呈阳性,初步判断,pepc基因已导入NC89型烟草植株中,并在烟草中表达。
【图文】：

示意图,表达载体构建,示意图,春化

图 2-1pepc 全长基因表达载体构建示意图 2-1 Schematic diagram of the construction of PEPC full length gene expression vector验方法高表达的 T3代纯合 pepc 转基因拟南芥植株的筛选1）配 500 mL 0.1 %的琼脂糖，高温高压灭菌 20 min，冷却至果冻状备2）将收获的 T1代种子放入 50 mL 离心管中，加入适量 0.1 %的琼脂糖入 4 ℃冰箱春化 2-3 d；3）将春化后的种子混合液用移液枪吸取，均匀滴至营养基质上（丹麦1），放入光照培养箱进行正常培养；4）待长出 4 片真叶的幼苗先用 10000 倍 Basta 溶液均匀喷洒植株叶片再用 5000 倍 Basta 溶液喷洒两遍；

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第二章磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）基因在转基因拟南芥中的初步表2.3.2 T3 代纯合 pepc 转基因拟南芥植株 PCR 电泳结果与分析提取 T3代纯合 pepc 转基因拟南芥植株的叶片总 DNA、野生型拟南芥叶和携带有 pepc 基因的大肠杆菌质粒 DNA，，根据含酶切位点的 pepc 全长目的测引物，进行 PCR 扩增，琼脂糖凝胶电泳图如下：
【学位授予单位】：河南科技学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943.2

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