利用CRISPR技术敲除兔细胞HGPRT基因

发布时间：2020-04-18 13:27

【摘要】：目的:利用CRISPR/Cas9技术,针对HGPRT目的基因设计打靶sgRNA,进行基因敲除并通过筛选单克隆技术等从而获得HGPRT基因缺陷型细胞株,为制备兔抗单克隆抗体打下良好基础。方法:利用GenBank找出HGPRT基因组的外显子区域。利用在线网站,输入第一个和最长的外显子序列作为靶序列,设计sgRNA,选出并筛选最优序列。构建CRISPER/Cas9重组真核质粒,利用慢病毒包装技术,通过293T细胞包装得到靶向兔HGPRT基因的病毒株。再利用构建的重组质粒包装获得的慢病毒侵染兔骨髓瘤细胞,通过药物Puromycin、6-TG和HAT选择培养基筛选,有限稀释法单克隆技术,获得的中靶阳性细胞克隆—HGPRT基因缺陷型的兔骨髓瘤细胞。结果:1、设计相对应的sgRNA,通过测序的方法验证了成功构建具有兔HGPRT基因敲除序列的CRISPR/Cas9重组质粒。2、利用重组质粒lentiCRISPR v2,包装辅助质粒psPAX2和pMD2.G三种质粒共同转染HEK293T细胞后,包装出具有基因敲除能力的慢病毒株。3、通过用浓缩的重组慢病毒侵染生长状况较好的对数生长期兔骨髓瘤细胞,分别用0.8μg/mL的Puromycin,梯度浓度的6-TG(6-疏基鸟嘌呤)进行加药筛选后再通过HAT选择培养基进行验证。通过有限稀释单克隆法分离得出中靶阳性单克隆细胞。4、将实验组的细胞扩培后提取DNA进行T7E1酶切验证,以及直接测序两种方法鉴定,成功筛选到HGPRT基因缺陷型单克隆细胞。结论:本课题通过CRISPER/Cas9技术,成功构建靶向敲除兔HGPRT基因的lentiCRISPR v2重组质粒,并包装浓缩出具有敲除HGPRT基因的慢病毒株,通过侵染后一系列的筛选和验证手段,建立了兔骨髓瘤HGPRT基因缺陷型细胞。该基因改造缺陷型细胞,为后续的兔抗单克隆细胞杂交实验打下了基础。
【图文】：

锌指,三维型,双链,相互作用

图１－２邋ＺＦＮｓ对靶ＤＮＡ序列的识别和切割（Ｍｉｌｌｅｒ邋ａｎｄ邋Ｈｏｌｍｅｓ，２００７）设计的左右ＺＦＮｓ相互作用，使ＦｏＫＩ在结锌指构域对ＤＮＡ双链进行切割；的三维模型逡逑２类转录激活因子效应物核酸酶（ＴＡＬＥＮｓ）逡逑．１邋定义逡逑转录激活样效应因子核酸酶（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ邋ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ邋ｅｆｆｅｃｔｏｒ邋ｎｕｃｌＥＮ）于１９８９年从植物病原菌黄单胞菌属（Ｘａｎ－ｔｈｏｍｏｎａｓ）中分离出来［６１由两个结构域构成，一个是行使精准切割作用的ＦｏＫＩ酶结构域，另ＬＥＮ蛋白特异性结合的ＤＮＡ结构域。由于ＴＡＬＥＮ蛋白中的ＤＮＡ较为固定，是由高度重复的氨基酸组合成１２－３０个高保守重复的Ｎ的特异性ＤＮＡ识别就是依靠这些重复单元上的氨基酸［６２，６３］，因此ＴＡＬＥＮ的核心区域。在这些重复单元中有两个较为特殊的氨基酸被

密码,分子,示意图,氨基酸

Ｌ＾ｌ邋ＪＩＦＰ逦ｃｓｏｍａｉｉｆｉ逡逑图１－２邋ＺＦＮｓ对靶ＤＮＡ序列的识别和切割（Ｍｉｌｌｅｒ邋ａｎｄ邋Ｈｏｌｍｅｓ，２００７）逡逑ａ）人工设计的左右ＺＦＮｓ相互作用，使ＦｏＫＩ在结锌指构域对ＤＮＡ双链进行切割；ｂ）图形逡逑的三维模型逡逑１．４．２类转录激活因子效应物核酸酶（ＴＡＬＥＮｓ）逡逑１．４．２．１邋定义逡逑转录激活样效应因子核酸酶（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ邋ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ邋ｅｆｆｅｃｔｏｒ邋ｎｕｃｌｅａｓｅ，，逡逑ＴＡＬＥＮ）于１９８９年从植物病原菌黄单胞菌属（Ｘａｎ－ｔｈｏｍｏｎａｓ）中分离出来［６１］。该逡逑酶主要由两个结构域构成，一个是行使精准切割作用的ＦｏＫＩ酶结构域，另一个逡逑是ＴＡＬＥＮ蛋白特异性结合的ＤＮＡ结构域。由于ＴＡＬＥＮ蛋白中的ＤＮＡ识别逡逑结构域较为固定，是由高度重复的氨基酸组合成１２－３０个高保守重复的单元。逡逑ＴＡＬＥＮ的特异性ＤＮＡ识别就是依靠这些重复单元上的氨基酸［６２，６３］，因此它们逡逑就是ＴＡＬＥＮ的核心区域。在这些重复单元中有两个较为特殊的氨基酸被称为逡逑可变双残基（ＲＶＤ，Ｒｅｐｅａｔ－Ｖａｒｉａｂｌｅ邋Ｄｉ－ｒｅｓｉｄｕｅｓ）［６４１。因为在这些保守的高重复单逡逑元中，只有这两个位于１２和１３的氨基酸是可以改变的。并且这个重复序列可逡逑变的双残基与四个碱基相对应
【学位授予单位】：福州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q78

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