高定植肝癌细胞株中差异表达基因SLC38A4、GJA1在肝癌肝内转移过程中的作用及机制研究

发布时间：2020-04-19 19:16

【摘要】：原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC),作为肝癌恶性肿瘤的一类,是我国发生率高且危害极大的恶性肿瘤之一。研究表明,肝内转移是肝癌的首要转移位点,也是肝癌致死的首要原因。目前对肝癌细胞的肝内转移过程虽有所了解,但是研究尚不深入,尚无有效治疗靶点和药物阻断肝癌肝内转移过程。因此需要进一步明确肝癌细胞肝内转移过程中的关键分子及其作用机制。除了自身抑癌或促癌基因的改变外,细胞与他们赖以生存的微环境之间的相互作用对于正常组织内稳态以及肿瘤组织的生长都是至关重要的。特别是肿瘤细胞与相关间质之间的相互作用形成了一个强大的关系网,可影响肿瘤的发生、进展和预后。肿瘤的转移是一个复杂的、多步骤、多因素参与的过程,包括原发肿瘤的形成、原发灶肿瘤细胞的局部侵袭,肿瘤细胞内渗入血管和淋巴管,在血管和淋巴管中的生存,外渗出血管和淋巴管,在远端定植灶的存活。肿瘤转移过程中,肿瘤的微环境发挥了重要的作用,其中包括肿瘤低氧环境、肿瘤相关的巨噬细胞、T细胞、NK细胞、树突状细胞、肿瘤相关的成纤维细胞以及内皮细胞等。任何肿瘤转移的最终结局都是在远端定植灶上形成新的肿瘤,肿瘤是如何在远端定植灶的存活和再生这个问题一直是科学家想攻克的难题。为了研究肿瘤转移过程的最终阶段-在远端定植灶的存活,筛选出能够高定植的细胞显得尤为重要。为了研究肝癌转移过程的最终阶段-在远端定植灶的存活,我们构建了脾脏注射-肝定植(转移)模型,利用该模型我们筛选获得了一系列的高定植(转移)能力的肝癌细胞株。利用表达谱芯片检测,根据P值0.05,差异倍数≥5倍,我们筛选到64条在高定植细胞中差异表达的mRNA。进一步在更多的高定植细胞中验证,以确保在除了芯片中的两株细胞以外至少还有另外两株高定植细胞表达符合差异基因的表达结果,以此我们筛选到31条基因,其中上调表达基因17条、下调表达基因14条。根据与肝癌临床病人预后之间的关系,最终我们筛选到SLC38A4、GJA1在高定植细胞株中普遍存在差异表达,在多个队列的肝癌组织样本中也存在差异表达,并且与肝癌病人的高复发率、差的预后相关。我们发现SLC38A4不仅在肝癌组织样本中下调表达并且随着肝癌的进展表达量逐渐降低,在肝脏发育过程中还呈现逐渐上调表达的趋势,且与肝癌病人的预后呈正相关,即肝癌病人SLC38A4含量越高,病人的预后情况越好。我们又对SLC38A4的临床预后进行研究,发现SLC38A4的表达情况与肝癌病人的肿瘤大小、TNM分期、BCLC分期、肿瘤转移以及血清AFP含量相关。随后进行了SLC38A4的生物学功能研究,干性球形成实验证实干扰SLC38A4增强肝癌细胞的干性能力;CCK8、乙炔脱氧尿甘结合染色(EDU)细胞增殖实验以及细胞周期检测证实干扰SLC38A4促进肝癌细胞增殖;划痕实验以及transwell实验证实干扰SLC38A4可以促进肝癌细胞的迁移、侵袭;裸鼠体内皮下荷瘤实验证实干扰SLC38A4促进肿瘤的增殖。上述结果证明SLC38A4为抑癌基因,干扰SLC38A4在体内体外条件下都可以促进肝癌的进展。Western blot结果显示干扰SLC38A4可以增加ERK和AKT磷酸化水平,表明干扰SLC38A4可以使肿瘤中的MAPK信号通路及PI3K/AKT信号通路活化,促进肝癌的进展和转移。我们对GJA1进行了研究,发现GJA1在高定植细胞中普遍高表达,在多个队列的肝癌组织中也是高表达,并且与肝癌病人的高复发率、差的预后呈正相关。裸鼠脾脏注射-肝定植体内实验证实,GJA1能够增强肝癌细胞的肝内定植能力。我们对过表达GJA1的细胞进行了体外功能学实验,CCK8、克隆形成、EDU检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期变化,transwell实验以及细胞划痕实验检测细胞迁移侵袭能力,我们发现过表达GJA1对细胞本身的增殖能力、迁移侵袭能力没有统计学意义的影响。为了探究高定植肝癌细胞株高定植的原因,我们对高定植肝癌细胞株进行裸鼠皮下荷瘤,发现体内情况下高定植细胞株所形成的肿瘤增殖更快,有更强的血管形成能力。我们将过表达GJA1的细胞进行裸鼠皮下荷瘤,CD31、CD34染色显示过表达GJA1细胞形成的皮下荷瘤有更高的血管密度。为了探究GJA1对血管形成的影响,我们用过表达GJA1细胞及对照组细胞的条件培养基刺激脐静脉内皮细胞(HUVEC)发现小管形成并无差异性改变。由于GJA1可以使两种细胞之间形成缝隙连接(gap junction),使其相互之间传递物质,我们猜测过表达GJA1的细胞可能和HUVEC通过直接接触后形成缝隙连接促进小管的形成,于是我们将过表达GJA1及对照的肝癌细胞与HUVEC进行共培养,我们检测到过表达GJA1细胞相对于对照细胞与HUVEC共培养后形成小管能力增强。综上所述,我们对肝癌转移过程中的最终环节-在定植灶中的存活进行了研究,发现在肝癌转移晚期即在定植灶的存活阶段时,肿瘤细胞中的基因SLC38A4以及GJA1在其中发挥了重要的作用。该项研究为进一步理解肝癌转移进程中肿瘤本身因素及微环境因素发挥的作用提供了新鲜的思路和视角,为肝癌的转移提供了潜在预防及诊疗靶点。
【图文】：

图 1-1. 高定植肝癌细胞株的筛选方法及验证Figure1-1．Screening methods and validation of highly colonization hepatocellularcarcinoma cell lines.(A) A Schematic Model of screening of highly colonization hepatocellular carcinomacells.

图 1-2. 高定植细胞株芯片结果分析Figure 1-2．The analysis of microarray data about the highly colonization cells.Heat map representation of microarray data about the expression levels of genes inhepa1-6 cells and highly colonization cells P6-3, P11-1.
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7

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本文编号：2633645