绿僵菌多聚泛素（Polyubiquitin）基因功能研究

发布时间：2020-04-19 23:43

【摘要】：绿僵菌作为一种双防真菌可以同时用于植物病害防治和植物虫害防治的丝状真菌。作为一种丝状真菌,绿僵菌主要包括有典型的两种不同生活史时期——分生孢子和菌丝体。此外,近年来,绿僵菌在昆虫病原真菌的遗传调节机制、致病机制及生物防治方面,被作为一种病原真菌的模式生物来研究。泛素(ubiquitin)一种76个氨基酸残基的高度保守的热稳定的小分子蛋白质,是调节生物体蛋白质的降解重要控制基因。在动植物以及丝状真菌中,多聚泛素(Polyubiquitin)是由不同数目的76个氨基酸残基串联在一起,组成的高保守的小分子蛋白质,多聚泛素主要通过泛素途径选择性的降解受损蛋白,参与干旱、高温、高盐、和重金属多种逆境应答。本研究以罗伯茨绿僵菌Metarhizium robertsii为研究对象;首先,对绿僵菌polyubiquitin基因--MrUBI4进行了生物信息学;其次,基于同源重组的原理,利用农杆菌介导的遗传转化技术,获得MrUBI4的基因敲除菌株(△MrUBI4)和回补菌株(△MrUBI4::MrUBI4);最后,通过比较敲除突变菌株(MT)与野生型菌株(WT)、回补突变菌株(Comp)在生长发育、抗逆、产孢量和毒力等方面的差异,从而明确MrUBI4的具体生物学功能。具体研究结果如下:1.本实验分析得到多聚泛素基因,并进行blast序列分析得到系统发育树和绿僵菌泛素化通路中蛋白分析。2.通过基因敲除技术获得了绿僵菌MrUBI4基因敲除菌株和回补菌株;3.进行性状分析,发现MT的孢子有明显畸形变化,生长速率和产孢量都有下降;在抗外界环境压力下,MT孢子萌发率明显降低;在抗化学压力下和侵染大蜡螟能力无明显变化。综上所述,MrUBI4基因敲除株的孢子形态产生畸形,菌落生长速率减弱,孢子产孢量减少,孢子抗紫外和热胁迫能力下降;这些结果说明MrUBI4对绿僵菌的生长发育和抗环境压力具有重要作用。
【图文】：

系统发育树

3.2.2 敲除株和回补株的获得与验证将 WT，MT，Comp 3 种菌株分别接种到 SDAY 培养基平板上，分别提取 DNA并分别使用 bar 基因、MrUBI4 基因和 ben 基因，，在分子水平验证 3 种菌株与该基因大小一致。将测序后的序列与 NCBI 上登录的菌株序列比对，完全一致。将 WT，MT分别提取 total RNA，并反转录成 cDNA 使用 MrUBI4 基因上游下游与 bar 基因组成的新的引物，在 RNA 分子水平验证 2 种菌株与该基因大小一致，分别阳性送样测序将测序后的序列与 NCBI 上登录的菌株序列比对，完全一致。
【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S476.12

【参考文献】

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本文编号：2633877