非洲野生稻落粒基因SH3的克隆及其分子演化

发布时间：2020-04-23 00:54

【摘要】：作物驯化是将野生种驯化为能够适应栽培环境并满足人类需求的过程。在驯化过程中,作物的植株形态、籽粒大小以及种子落粒性等性状均发生了显著变化。其中,落粒性的丧失是禾本科作物驯化的关键一步。落粒性驯化关键基因的分离鉴定及分子进化研究将有助于探索作物的起源与演化。本研究采用图位克隆策略克隆了一个非洲稻落粒性驯化的关键基因,并对其进化进行了分析,主要研究结果如下:1.利用非洲野生稻(Oryza barthii A.Chev.)W1411 和非洲栽培稻(Oryza glaberrima Steud.)IRGC104165构建的分离群体,在第三染色体定位到一个落粒性基因ObSH3(Oryza barthii Seed Shattering3),进一步利用次级分离群体和新开发的分子标记最终将ObSH3基因定位在分子标记SNP29和SNP31之间。这两个分子标记之间的物理距离在非洲栽培稻IRGC104165基因组中为17-kb,而在非洲野生稻W1411基因组中为63-kb。与非洲栽培稻IRGC104165相比,该区间有一个大小为45.5-kb的插入片段,该定位区间预测有6个基因,分别命名为ORF1-ORF6。RT-qPCR分析表明,在这6个基因中只有ORF3基因在离层区域高丰度表达,因此将该基因作为ObSH3的候选基因。2.利用CRISPR-Cas9基因编辑技术对W1411的ORF3基因进行敲除,在T1代转基因植株中,分别获得了 1-bp插入、5-bp缺失以及19-bp缺失等三种不同类型的纯合突变株系。这三种类型的转基因株系均表现为不落粒,该结果表明ORF3就是控制非洲野生稻落粒性状的ObSH3基因。同时,我们构建了该基因的基因组互补载体、超表达载体以及RNAi载体,这些载体的转基因研究结果进一步验证了 ORF3就是ObSH3基因。3.RT-qPCR分析表明,ObSH3基因主要在小穗离层、叶片、茎等部位表达。GUS染色结果与RT-qPCR结果基本一致。mRNA原位杂交分析表明,ObSH3在小穗的离层部位具有强烈的表达。以上这些结果表明,ObSH3的表达模式与其调控离层的形成与发育这一功能相一致。4.ObSH3是一个YABBY家族的转录因子,亚细胞定位结果表明ObSH3定位在细胞核上,这与该基因被预测为转录因子这一结果是一致的。氨基酸序列分析表明ObSH3编码蛋白的锌指结构域以及YABBY结构域在单子叶植物中是高度保守的。5.通过对91份非洲栽培稻中SH3基因和GL4/SH4基因(位于4号染色体上控制落粒的基因)的基因型以及地理分布进行分析发现,有11份非洲栽培稻仅含有SH3缺失变异,有51份仅含有SH4变异,剩余的29份同时含有这两个基因变异。这表明在非洲栽培稻驯化过程中,SH3缺失变异受到了强烈的选择。由于这11份只包含SH3缺失变异的非洲栽培稻均集中位于非洲西部的几内亚、塞拉利昂和利比里亚等地区,据此推测这一区域可能是SH3变异的起源地。ObSH3的分离鉴定不仅阐明了水稻离层发育的分子机制,同时也为非洲栽培稻的驯化过程提供了新的分子证据。
【图文】：

示意图,载体,示意图,溶液

。ｍｇａｓｅｍ３７°0５１１１丨１１，并重复。转入０．２）＜８５（：中，５５°（：１１１。转入丁８３中，片摆放在托盘内，加入Ｒｏｃｈｅ／Ｔｒｉｔｏｎ溶液以及ＢＳＡ／Ｔｒｉｔｏｎ溶液，转入含有ＢＳＡ溶液中，置于室温摇床４５邋ｍｉｎ。滴加抗体溶液片，室温下摇床上Ｗ邋ＢＳＡ／邋ｔｒｉｔｏｎ液体震荡漂洗４次。转入Ｂｕｆｆ色底物溶液，置于考普林杯中显色２？３邋ｄ。逡逑将样品玻片在ＴＥ溶液中漂洗２次，乙醇梯度脱水处理，再加拿大树胶封片，，晾干后即可观察。逡逑建逡逑基因编辑载体构建逡逑稻Ｗ１４１１的基因ｃＤＮＡ序列非保守区域设计四个靶加入价ａｌ酶切位点），以ｓｇＲＮＡ骨架＋ＯｓＵ３启动子为模板ｐＳ奶进行酶切，将ＰＣＲ扩增片段与酶切载体片段稻Ｗ１４１１的基因靶序列的基因编辑载体，经测序成功ｉ２－ＯｂＳＨ３邋0逡逑；？＇■邋０0？逡逑■邋０ｒｖｊ？ｒ邋？＇逡逑

载体,示意图,野生稻,参考序列

论文逦互补载体构建逡逑Ｗ１４１１为参考序列设计引物，并分别在引物上加入母《邋Ｉ得到包含基因起始密码子ＡＴＧ前约２．３－ｋｂ以及终为１２－ｋｂ的互补片段，对ＰＣＲ产物进行纯化回收；用体进行酶切，回收纯化后将两个回收产物混合进行重组连载体上，得到含有非洲野生稻Ｗ１４１丨的ＯＭ／／３名为ｐＯＭＺ／３。逡逑Ｓ．ＡＫｌｆｌ）逡逑
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S511.9

【参考文献】