LncRNA-AK123483的靶向基因PARP、caspase-3在心肌缺血再灌注损伤中的调控机制

发布时间：2020-04-23 02:24

【摘要】：研究背景:尽管静脉溶栓、经皮冠状动脉腔内成形术、冠状动脉内支架置入等心脏再灌注治疗,可以显著提高患者的存活率,但缺血心肌在恢复血流灌注过程中,会出现再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI).心肌缺血再灌注损伤的机制尚未完全明白,但如何防治再灌注损伤一直成为心血管领域研究的热点。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类具有基因调节功能的内源性非编码小分子RNA,可以通过识别3端非编码区(3'-uncoding region,3'URT)与其靶向信使RNA(message RNA,mRNA)相结合,降解靶mRNA或阻遏靶mRNA的翻译,降低蛋白表达水平。在占据人类全基因组98.5%的非编码RNA中,绝大多数被转录成长度大于200nt的 RNA 分子,由此称为长链非编码 RNA(long non-coding RNA,LncRNA。LncRNA在多个层面上参与细胞分化和个体发育等重要生命过程的调节,并与人类的重大疾病密切相关。在前期相关研究中发现,通过生物信息学对GSE50378芯片数据进行分析中,LncRNA-AK123483基因在A/R心肌细胞中异常表达。因此认为,LncRNA-AK123483与心肌缺血再灌注损伤过程存在着密切联系,但在心肌缺血再灌注损伤中是如何参与调控机制的过程,正是本研究关注的问题。因此,我们拟通过利用大鼠心肌细胞(H9c2)构建缺氧/复氧模型,研究LncRNA-AK123483和心肌缺血再灌注损伤相关基因(PARP、caspase-3)的相互作用关系,从而明确LncRNA-AK123483在心肌缺血再灌注损伤过程中的调控机制。研究方法:在NCBI-GEO数据库中获得lncRNA-mRNA芯片表达谱GSE50378和GSE22282,并通过R软件包(EdgeR)对处理组和对照组的lncRNA表达谱进行差异表达分析,经过筛选和两组表达谱比对分析发现LncRNA-AK123483基因异常表达,因此,挑选LncRNA-AK123483作为本次研究的对象。应用qRT-PCR的方法在正常组、缺氧/复氧心肌细胞中的表达情况进行检测。采用siRNA干扰技术干扰LncRNA-AK123483的表达后,比较分析正常组与缺氧/复氧心肌细胞中乳酸脱氢酶(LDH)的活性及细胞的凋亡情况。最后通过Western blot方法检测PARP(多聚ADP核糖聚合酶)和Caspase-3基因的表达水平。结果:在本次研究中,从GEO数据库中下载了 gse50378和gse22282两组芯片数据并对筛选其差异表达基因。其中,GSE50378芯片数据中,lncRNAak123483的差异表达倍数最显著,因此挑选LncRNA-AK123483用于后续的研究。与正常心肌细胞相比,A/R(缺氧、复氧)心肌细胞中的LncRNA-AK123483表达水平、LDH酶的活性和细胞凋亡程度均显著提高。经对A/R(缺氧、复氧)心肌细胞与正常细胞的LncRNA-AK123483干扰处理并对LDH的活性及细胞凋亡程度进行检测和分析,结果表明,A/R(缺氧、复氧)心肌细胞中的LDH的活性及细胞凋亡程度显著降低,但在正常细胞中的LDH的活性及细胞凋亡程度并无显著变化。乳酸脱氢酶(LDH)一直被认为是血管内溶血中重要的临床指标。它存在于癌症患者的血清中,可作为胰腺癌、骨肉瘤、肾癌或睾丸癌患者预后的标志物。LDH-5酶可以催化人体内丙酮酸与乳酸之间的转换,在厌氧条件下细胞代谢中扮演着非常重要的作用。此外,LDH-5在非小细胞肺癌中,它与肿瘤缺氧、血管形成因子的生成和预后不良有关。本次实验结果表明,缺氧和复氧(A/R)可以提高LDH的含量,但是经敲除lincRNA AK123483后可以降低LDH的含量。通过Western blot方法对LncRNA-AK123483干扰前后的PARP(多聚ADP核糖聚合酶)、Caspase-3基因的表达水平进行检测和分析,结果发现,在干扰前,A/R(缺氧、复氧)心肌细胞中的PARP(多聚ADP核糖聚合酶)、Caspase-3基因的表达水平显著高于正常细胞;相反,经LncRNA-AK123483干扰后,A/R(缺氧、复氧)心肌细胞中的PARP(多聚ADP核糖聚合酶)、Caspase-3基因的显著降低。PARP(多聚ADP核糖聚合酶)负责应对许多内源性和环境遗传毒性药物蛋白质的翻译后修饰。它是一种保守的核蛋白,它能迅速、直接结合和剪切单链和双链DNA。PARP基因存在于多数真核细胞中的多功能性蛋白,可以识别受损的DNA缺口而被激活从而对DNA进行修复和参与细胞代谢调节过程,如DNA修复、基因转录、细胞周期进程、细胞死亡、染色质功能和基因组稳定性。PARP-1参与DNA修复和DNA损伤激活。抑制PARP-1可能通过激活SIRT1增加线粒体代谢。细胞凋亡存在于许多生物学过程中,在肿瘤、神经退化性疾病中起到了至关重要的作用。Caspase-3被认为是细胞凋亡过程中的关键蛋白酶。在程序性细胞死亡过程中,caspase-3的激活导致DNA修复蛋白、细胞骨架蛋白的降解。Caspase-3激活ROCK-1在心肌细胞凋亡中起着重要的作用。结论:研究结果表明,LncRNA-AK123483的上调表达促进了心肌缺血再灌注损伤的发生。LncRNA-AK123483的敲除影响PARP和caspase-3基因的表达,从而对因缺血再灌注导致的受损心肌细胞进行修复和保护作用。这可为减轻心肌缺血再灌注损伤的治疗中提供一种新的思路和方法。在本次研究中,在A/R处理组中lncRNA-AK12383基因的敲除引起心肌细胞凋亡率显著降低,但在对照组中敲除LncRNA-AK123483对心肌细胞的凋亡情况并无显著影响。由此说明,LncRNA-AK123483基因可能参与了缺氧/复氧等外界应激因素诱导细胞凋亡途径,而不参与细胞程序性死亡的过程。我们只考察了 LncRNA-AK123483对心肌细胞凋亡的作用,LncRNA-AK123483对心肌细胞迁移的影响还需要进一步探索。在本次研究中该发现了一些非常重要的分子标记物,如:Ki-67、Caspase6、Bax、Bcl-2、Bax X1等标志物,在今后的研究中我们将会对以上标记物进行功能验证,并分析其在缺血再灌注损伤发生过程中的作用。本次实验结果表明,长链非编码RNA AK123483可能是心肌缺血再灌注损伤潜在的治疗靶标。
【图文】：

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浙江大学博士学位论文逦结果与分析逡逑２、ＧＳＥ５０３７８和ＧＳＥ２２２８２的差异表达ＬｎｃＲＮＡ热图制作逡逑从热图中可以明显看出，在ＧＳＥ２２２８２芯片数据中，共筛到了具有代表性的异逡逑常表达ＩｎｃＲＮＡ共有６５个，其中有３０下调表达和３５个上调表达的ＩｎｃＲＮＡ。在逡逑ＧＳＥ５０３７８芯片数据中，共筛选到了邋２６个共差异表达的ＬｎｃＲＮＡ，其中包括８个上逡逑调表达ＬｎｃＲＮＡ，邋１８个显著下调表达的ＬｎｃＲＮＡ。在ＧＳＥ５０３７８芯片数据中，逡逑ＬｎｃＲＮＡ－ＡＫ２４８９８、ＬｎｃＲＮＡ－ＡＫ１２３４８３、ＬｎｃＲＮＡ－ＡＫ８９９４０邋差异表达最为显著，，逡逑说明这些ＬｎｃＲＮＡ可能起着最为重要的作用。此外，在ＧＳＥ２２２８２芯片数据中，逡逑ＬｎｃＲＮＡ－ＡＹ２１６２６５、ＬｎｃＲＮＡ－ＢＣ０４０８３４、ＬｎｃＲＮＡ－ＡＢＯ邋１９５６２邋，邋ＬｎｃＲＮＡ－逡逑ＢＣ０２４０２０、ＬｎｃＲＮＡ－ＡＫ０２３３３０等在ＧＳＥ２２２８２芯片数据中异常上调表达，其中差逡逑异表达倍数最高达ｌ0ｇ［ＦＣ］＝２．逡逑ＧＳＥ５０３７８逦逦邋ＧＳＥ２２２８２逡逑＂

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Ｆｉｇｕｒｅ邋２邋Ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ＧＯ邋ａｎｄ邋ＫＥＧＧ邋ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ邋ｉｎ邋ＧＳＥ５０３７８邋ｔｈａｔ邋ｗａｓ逡逑ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ邋ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ｇｅｎｅｓ．逡逑注：图２－Ａ代表差异表达基因ＧＯ富集结果，图２－Ｂ代表差异表达基因ＫＥＧＧ代逡逑谢通路富集结果。从ＧＯ富集的结果中看：共有１１条Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ邋Ｐｒｏｃｅｓｓ、７条逡逑Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｕｎｃｔｉｏｎ；４条Ｃｅｌｌｕ丨ａｒＣｏｍｐｏｎｅｎｔ；这些差异表达基因所富集到的ＧＯ逡逑和ＫＥＧＧ代谢通路的信息，见附表３和附表４。逡逑（２）在ＧＳＥ５０３７８的ＤＥＧｓ的ＧＯ富集结果如图３和附表１所示。在ＧＯ富集逡逑的通路中共富集到了邋４５邋条邋Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｆｕｎｃｔｉｏｎ、１２７邋条邋Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ邋Ｐｒｏｃｅｓｓ邋和邋３２邋条逡逑Ｃｅｌｌｕｌａｒ邋Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ条目。在Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｆｕｎｃｔｉｏｎ功能项中，ＤＥＧｓ主要富集在分子逡逑功能、胞外空间、细胞外区域、细胞表面、质膜的整体组分等等；在Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ邋Ｐｒｏｃｅｓｓ逡逑功能项中：ＤＥＧｓ主要富集在炎症反应、免疫反应、趋化因子介导的信号传导途径、逡逑信号传导、细胞间传递、正面调节炎症反应等等
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R542.2

【参考文献】