结肠癌细胞SW480中差异表达miR-18a-5p、miR-802及其靶基因功能研究

发布时间：2020-04-23 08:01

【摘要】：本研究以miR-18a-5p和miR-802为研究对象,检测过表达miR-18a-5p和miR-802模拟物对结肠癌SW480细胞增殖、凋亡的影响作用,预测mi R-18a-5p和miR-802可能调控的靶基因。通过双荧光素酶实验,qRT-PCR等方法验证miR-18a-5p和miR-802及其靶基因之间的相互作用关系;构建过表达microRNA的瞬时真核表达载体,分析过表达miR-18a-5p和miR-802及其调控靶基因参与的信号通路的影响,讨论miR-18a-5p和miR-802对结肠癌发生发展的分子机制。1.本研究中利用Lipofectamin?3000转染试剂经脂质体瞬时转染技术将过表达miR-18a-5p和miR-802模拟物转染到SW480细胞,检测转染后在不同时间24h、48h、72h内的转染效率;实时荧光定量qRT-PCR结果显示:成功建立瞬时过表达miR-18a-5p和miR-802的结肠癌SW480细胞模型;在48h达到高峰,过表达miR-18a-5p和miR-802模拟物转染到结肠癌SW480细胞中的相对表达量分别为57.38±8.38,24.62±4.22;利用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测过表达miR-18a-5p-eGFP组、NC-eGFP组、空白对照组转染结肠癌SW480细胞在不同浓度模拟物(质粒DNA)50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL和200μg/mL在不同时间12h、24h、48h及72h内对结肠癌SW480细胞生长所产生的增殖抑制作用,MTT检测结果显示质粒DNA浓度为200μg/mL时抑制作用比较好,过表达miR-18a-5p模拟物显著抑制结肠癌SW480细胞的增殖,增殖抑制作用呈剂量和时间依赖性。质粒DNA浓度为200μg/mL转染时间12h、24h、48h及72h内的增殖抑制率分别为26.80%、46.37%、66.02%及74.66%;不同浓度在不同时间12h、24h、48h和72h内有显著性差异(P0.05)。2.通过Annexin V-PE/7-AAD双染色法,用流式细胞仪检测过表达miR-18a-5p-eGFP组、阴性对照NC-eGFP组在不同时间24h、48h、72h内转染结肠癌细胞后的凋亡率。结果表明,过表达miR-18a-5p模拟物(miR-18a-5p-eGFP)转染到结肠癌SW480细胞诱导凋亡时间依赖性。最后应用实时荧光定量qRT-PCR方法,以β-actin作为内参对照转染后的SW480细胞总RNA,qRT-PCR法检测mRNA为模板检测出DUSP5、FZD3及CCND2基因mRNA转录水平的变化。结果显示:DUSP5和FZD3基因的mRNA转录水平上调表达,差异表达倍数分别为2.15、1.74(2~(-△△Ct)比较P0.01),而且CCND2基因的mRNA转录水平下调表达,差异表达倍数为0.62(2~(-△△Ct)比较P0.01),实验结果提示,过表达mi R-18a-5p对SW480细胞具有增殖抑制和诱导细胞凋亡作用,机制可能过表达miR-18a-5p通过MAPK、Wnt和PI3K-AKT信号通路靶向调控DUSP5、FZD3基因的上调表达及CCND2基因的下调表达有关。3.miR-802调控的靶基因HSPA6、TCF7L2及NKD1 mRNA转录水平;qRT-PCR实验结果显示:NKD1、HSPA6靶基因的mRNA转录水平上调表达,差异表达倍数分别为4.22、3.17(2~(-△△Ct)比较P0.01),而且TCF7L2基因的mRNA转录水平下调表达,差异表达倍数为0.25(2~(-△△Ct)比较P0.01);本实验数据与靶基因芯片结果一致,各基因mRNA表达的改变趋势符合前期芯片结果,进一步验证芯片结果的精准程度。miR-18a-5p和miR-802在人结肠癌发生发展中起抑癌作用,因此miR-18a-5p、miR-802是治疗人结肠癌的重要分子靶点。
【图文】：

筛选出靶基因。体及质粒 DNA 抽提熟 miRNA 序列，按照 Hsa-miR-18a-5p72 ） 的 成 熟 miRNA 序 列 ：G-3`，，设计合成带有末端保护碱基、sa-miR-18a-5p 引 物 。 引 物 序 列 ：：AATCTACTGCAGTGAAGGCACTTG-3ATCCGGTGGATCCGTGCAACTATGC-18a-5p 序 列 ， 构 建 真 核 过 表 达（ miR-18a-5p-eGFP) 、 插 入 空 载 体3` ） 的 阴 性 对 照质 粒

MIMAT0004185）的成熟 miRNA 序列：U-3`；Hsa-miR-802-pGV251-EGFP 质粒CTCCGAACGTGTCACGT-3′）的阴性对in 质粒（SV40-NC-eGFP），设计合成带位点的 Hsa-miR-802 引物。引物序列：GACGCGGGATCTGTTTCTCTGCAGCR:5`-CAGCGGTTTAAACTTAAGCTAA 将 miR-18a-5p-eGFP 、 NC-eGFP 和 50 mg/mL 卡那霉素的 LB 培养基中，220粒小体试剂盒说明书抽提真核 miRNA 质NA 浓度和纯度合格，可用于后续实验。
【学位授予单位】：新疆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.35

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本文编号：2637525