稳定低表达PLK1基因的Raji细胞中EB病毒基因的检测

发布时间：2020-04-23 18:47

【摘要】：目的:Polo样激酶1(polo-like kinase 1,PLK1)在人类肿瘤中过度表达,我们前期实验也发现PLK1基因在EBV转化的淋巴母细胞LCLs中高表达。本实验采用CCK-8实验和Hoechst染色观察干扰PLK1基因表达后Raji细胞的增殖和凋亡情况,并通过荧光定量PCR和Western blot检测稳定低表达PLK1基因的Raji细胞中EB病毒基因的表达情况,进一步研究EB病毒与宿主细胞的相互作用。方法:培养稳定低表达PLK1基因的Raji细胞,倒置荧光显微镜观察细胞内绿色荧光情况,采用CCK-8实验和Hoechst染色观察干扰PLK1基因表达后Raji细胞的增殖和凋亡情况,通过q RT-PCR技术验证PLK1干扰效果。采用q RT-PCR和Western Blot检测稳定低表达PLK1基因的Raji细胞中EBV基因的表达情况。结果:1.培养稳定低表达PLK1基因的Raji细胞。通过倒置荧光显微镜观察转染组(Raji/PLK1 sh RNA和Raji/NC)细胞,携带绿色荧光的细胞数达70%;实时荧光定量PCR检测表明干扰组(Raji/PLK1 sh RNA)与无意义sh RNA载体对照组(Raji/NC)和空白组(Raji)相比,PLK1基因在m RNA水平的表达均明显降低,表明稳定低表达PLK1基因的Raji细胞系干扰效果良好。2.干扰PLK1基因表达可抑制Raji细胞增殖并促进细胞凋亡CCK-8结果显示:干扰组Raji/PLK1 sh RNA细胞的生长速度明显低于Raji/NC细胞和Raji细胞(P0.01),差异有统计学意义,提示干扰Raji细胞中PLK1基因的表达可抑制Raji细胞生长。Hoechst染色结果显示:细胞经Hoechst 33342/PI双染后涂片,镜下发现Raji细胞和Raji/NC细胞呈弱蓝色荧光+少量红色荧光,而Raji/PLK1 sh RNA细胞呈强蓝色荧光+少量红色荧光,Raji/PLK1sh RNA细胞组中凋亡细胞明显多于Raji细胞和Raji/NC细胞组,提示干扰Raji细胞中PLK1基因的表达可诱导Raji细胞发生细胞凋亡。3.干扰PLK1基因的表达可影响EBV基因的表达本研究采用荧光定量PCR和Western blot方法检测干扰Raji细胞中PLK1基因表达前后,EB病毒潜伏基因的表达变化,发现抑制PLK1基因表达,可上调EB病毒基因LMP-1、LMP-2A和EBNA-1,而LMP-2B、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C和EBNALP基因表达未发现有明显差异。结论:干扰Raji细胞中PLK1基因的表达可抑制Raji细胞生长、诱导细胞凋亡,并上调EB病毒基因LMP-1、LMP-2A和EBNA-1的表达。
【图文】：

第 3 章 结果3.1 荧光显微镜观察结果首先培养 Raji/PLK1 shRNA、Raji/NC 和 Raji 细胞，各取一瓶处于生长对数期且无污染的细胞，在荧光显微镜下观察并拍照。如图 3.1 所示，未做任何处理的 Raji 细胞无任何荧光信号，而转染组 Raji/PLK1 shRNA 和 Raji/NC 细胞可见强绿色荧光，且同一视野下与白光细胞图片相比携带绿色荧光的细胞数达 70%以上，，提示转染有效。

为 GAPDH 和 PLK1 基因的扩增曲线及融解曲线。图 3.4 为 RaLK1 shRNA 三组细胞 2-ΔΔCt值的统计分析图。Raji/PLK1 shRN因在 mRNA 水平的表达明显低于 Raji/NC 细胞及 Raji 细胞，计学意义，表明转染 pLenR-GPH-hPLK1-sh 质粒的 Raji 细胞中NA 水平的表达明显下降，可进行后续实验。
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R733.1

【参考文献】

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本文编号：2638035