抑制MMP-10、MMP-13基因对人舌鳞癌细胞株CAL-27细胞功能的影响

发布时间：2020-04-23 17:39

【摘要】：在世界范围内,口腔癌约占全世界恶性肿瘤的3%,口腔癌中以舌癌最常见。虽然科学技术的飞速发展使医疗水平不断提升,舌癌的治疗手段也因此得到不断改善,但患者的五年生存率仍然不高,术后的生存质量也不尽如意。因此,从分子水平研究舌癌发生发展、侵袭转移的分子机制,以期望实现舌癌的分子靶向治疗、提高患者生存质量和预后成为研究的热门。本课题组前期通过转录组测序发现基质金属蛋白酶MMP-10、MMP-13在舌癌组织中相对高表达,与舌癌密切相关。因此,本课题拟通过研究抑制MMP-10、MMP-13基因后舌癌细胞CAL-27增殖、侵袭、迁移能力的变化,进一步明确它们在舌癌中发挥的作用,并探讨其可能的机制,为舌癌的治疗提供新思路。目的研究抑制MMP-10、MMP-13对舌癌细胞CAL-27增殖、侵袭迁移能力的影响,为舌癌基因靶向治疗提供理论基础和临床依据。方法第一部分:筛选及进一步验证舌癌癌及癌旁组织差异基因。由上海众信生物技术有限公司通过对5对舌癌患者的癌组织和癌旁组织进行基于NGS的RNAseq测序,初步筛选出部分差异基因MMPs;将收集的舌癌及癌旁组织标本应用q RT-PCR方法对差异基因MMPs进行进一步验证。第二部分:探讨抑制MMP-10、MMP-13基因对舌癌细胞株CAL-27生物学行为的影响。用针对MMP-10和MMP-13基因序列分别设计合成相应的si RNA,转染CAL-27细胞,通过Realtime PCR技术检测两个基因在RNA水平的表达变化,筛选出两条干扰效果较好的si RNA;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)验证两个基因在蛋白水平的表达变化。运用CCK8法和平板克隆形成实验研究MMP-10、MMP-13被干扰后CAL-27细胞增殖能力的改变;采用划痕愈合实验及侵袭小室法研究MMP-10、MMP-13被干扰后CAL-27细胞迁移、侵袭能力的改变。第三部分:建立动物模型观察抑制舌癌高转移细胞株MMP-10表达后癌细胞在裸鼠体内转移能力的改变。构建靶向抑制MMPs基因的慢病毒载体,感染舌癌高转移细胞株,建立裸鼠舌部原位癌模型,观察及计算各组的淋巴结转移率。结果第一部分:RNA-seq测序结果显示5对癌组织中MMP-10、MMP-13相对高表达,应用q RT-PCR方法进一步验证也发现两个基因在大部分舌癌组织中相对高表达。第二部分:si RNA-MMP-10/si RNA-MMP-13转染CAL-27细胞后,Real-time PCR及Western blot结果显示相应的MMP-10/MMP-13在RNA水平及蛋白水平表达下调;CCK8法和平板克隆形成实验显示si RNA-MMP-13转染后细胞增殖能力明显低于阴性对照组;划痕愈合实验、侵袭小室结果表明,MMP-10/MMP-13表达下降后CAL-27细胞的迁移、侵袭能力也随之下降。第三部分:慢病毒抑制稳转细胞组1336组MMP-10蛋白较NC组表达下调,迁移能力较NC组降低,我们选择1336组稳转细胞和NC组稳转细胞进行动物实验发现1336组裸鼠淋巴结转移率较NC组下降。结论MMP-10、MMP-13在癌组织中相对高表达;抑制MMP-13基因后CAL-27细胞的增殖、迁移、侵袭能力均减弱;抑制MMP-10基因后CAL-27细胞的迁移、侵袭能力均减弱;MMP-10、MMP-13基因可能对人舌鳞癌的增殖、迁移和侵袭起到一定的促进作用。
【图文】：

结 果 舌癌及癌旁组织收集情况收集 52 例舌癌及癌旁组织来自福建医科大学附属第一医院行舌癌切除术的新鲜织标本，每例包癌及癌旁组织，置于已经标记好的冻存管中，并迅速置于-80°冰箱储存，用于组织 RNA 的提取。 RNA-seq 测序结果上海众信生物技术有限公司对 5 对舌癌患者的癌组织和癌旁组织进行 RNA-seq序，对数据进行分析，我们发现与对应的癌旁组织相比，MMP-10、MMP-13 在舌癌组织中均呈现高表达，其在癌与癌旁组织中的表达量均数比值分别为 319.8334 和9.0876。

表 1.5 所示为其中一次一对舌癌及癌旁组织 RNA 提取的浓度和纯度，表 1.5所示 RNA 的浓度和纯度，纯度均在 1.80 以上，表明所提取的 RNA 达到标准，，可以用于逆转录实验。表 1.5 RNA 浓度及纯度处理组 浓度（μg/μl） OD260/OD280Tumor 0.5824 1.91Normal 0.6426 1.943.2 Real-time PCR 检测结果用 qRT-PCR 测定 52 对舌癌组织及癌旁组织中 MMPP-10、MMP-13 的相对表达量，并计算ΔCt，作图 1.2，如图所示，MMP-10、MMP-13 在舌癌组织中的表达量高于癌旁组织 (P<0.0001，)，其中 90%（47/52）的舌癌组织中 MMP-10的表达量高于旁癌组织，88%（46/52）的舌癌组织中 MMP-13 的表达量高于旁癌组织。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.86

【参考文献】

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本文编号：2637979