过表达分析候选基因A00981和A03231对枝状枝孢霉MD2紫杉醇合成的影响

发布时间：2020-04-26 09:26

【摘要】：紫杉醇是一种临床上广泛应用的抗癌药物。产紫杉醇内生菌是具有极大开发价值的紫杉醇药源途径之一。但是,目前已报道的40多个属的产紫杉醇内生真菌均存在紫杉醇产量低且不稳定的问题,尚无法实现工业化生产。基于真菌紫杉醇代谢途径的定向遗传改造,是获得紫杉醇稳定高产的基因工程菌株、实现其工业化应用的主要途径之一。而克隆真菌的紫杉醇合成相关基因并明晰其功能,是利用基因工程技术提高真菌紫杉醇产量的前提。本研究以产紫杉醇真菌枝状枝孢霉(简称:枝霉)(Cladosporium cladosporioides)MD2为研究对象,在其基因组和转录组测序的基础上筛选候选基因,克隆其中5个候选基因的DNA全长序列并采用生物信息学方法分析其结构和预测其功能,构建候选基因A00981和A03231的过表达转基因菌株,分析过表达候选基因A00981和A03231对枝霉MD2紫杉烷类合成的影响,为后期深入揭示这两个候选基因的功能以及枝霉MD2紫杉醇合成的分子机制奠定基础,同时也为紫杉醇高产基因工程菌株的创建提供基因资源。本研究主要结果如下:(1)根据枝霉MD2的基因组和转录组测序结果,寻找差异表达基因并克隆其中5个候选基因的DNA全长序列,通过比对候选基因的DNA全长序列和其CDS序列,发现候选基因A12109和A11767无内含子,A10817和A00981各含有一个内含子,A11450含有两个内含子。(2)利用生物信息学方法预测5个候选基因的潜在功能,结果显示:数据库中无与候选基因A12109编码蛋白匹配的信息,预示其可能为新基因;候选基因A11767的编码蛋白与Ascochyta rabiei的zinc ion binding protein的一致性最高(37%);候选基因A00981编码蛋白与Blastomyces gilchristii SLH14081的acyl-CoA dehydrogenase的一致性最高(71%);候选基因A10817编码蛋白与Rachicladosporium antarcticum的putative aryl-alcohol dehydrogenase AAD1的一致性最高(75%);候选基因A11450编码蛋白与Aureobasidium melanogenum CBS 110374的S-2-hydroxy-acid oxidase的一致性最高(59%)。(3)构建候选基因A00981的过表达载体,并采用农杆菌AGL-1介导转化枝霉MD2,共获得13株pTFCM-A00981转基因菌株。Southern blot检测结果表明,5株转基因菌株(编号为ZB、ZC、ZF、ZH和ZL)的外源基因为单拷贝方式整合。QRT-PCR检测结果表明,转基因菌株ZC中候选基因A00981的表达量最高,是对照(未转基因枝霉MD2)菌株的2.0倍。HPLC检测结果表明,相对于对照菌株的紫杉醇(1.06±0.02μg/mL)、巴卡亭III(2.62±0.05μg/mL)和10-去乙酰巴卡亭III(2.55±0.05μg/mL)产量,A00981-转基因菌株ZC中的紫杉醇(1.05±0.02μg/mL)、巴卡亭III(2.69±0.05μg/mL)和10-去乙酰巴卡亭III(2.46±0.05μg/mL)产量均无明显变化,初步说明过表达候选基因A00981对枝霉MD2的紫杉醇、巴卡亭III及10-去乙酰巴卡亭III的合成无明显影响。(4)构建候选基因A03231的过表达载体并转化枝霉MD2,共获得9株pTFCM-A03231转基因菌株。Southern blot检测结果表明,5株转基因菌株(编号为XA、XF、XG、XH和XI)的外源基因以单拷贝方式整合到宿主基因组。QRT-PCR检测结果表明,转基因菌株XH中候选基因A03231的表达量最高,是对照菌株的2.0倍。HPLC检测结果表明,与对照菌株相比,A03231-转基因菌株XH中紫杉醇(0.99±0.02μg/mL)和巴卡亭III(2.64±0.05μg/mL)的产量无明显变化,10-去乙酰巴卡亭III(1.59±0.03μg/mL)的产量降低了37.6%,初步说明过表达候选基因A03231对枝霉MD2的紫杉醇和巴卡亭III的合成无明显影响,但降低了10-去乙酰巴卡亭III的产量。
【图文】：

琼脂,基因组,浓度

00981、A10817 和 A11450 作为候选基因进行后续研究（图2.1）。用 SDS-CTAB 法提取枝霉 MD2 的基因组 DNA，测得其浓度约为 500 ng/μL，琼脂

序列,内含子,序列,区间分

DNA 序列为 912 bp，无内含子；候选基因 A00981 的 DNA 序列为 9694 bp，有 1 个内含子，内含子长 79 bp，区间为（455，531）；候选基序列为 854 bp，，cDNA 序列为 744 bp，有 1 个内含子，内含子长 1，323）；候选基因 11450 的 DNA 序列为 1287bp，cDNA 序列为 1，内含子长度分别为 106 bp、77 bp，区间分别为（131，238）和（）。M 1 4M1235
【学位授予单位】：中南民族大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q78

【参考文献】