拟南芥转录因子MS188调控孢粉素合成基因表达的研究

发布时间：2020-04-27 07:45

【摘要】：花粉壁能够保护花粉粒不受外界环境破坏,并帮助促进花粉与柱头识别和水合以完成受精过程。成熟花粉壁分为花粉外壁和花粉内壁,花粉外壁又可分为外壁外层和外壁内层。模式植物拟南芥花粉的外壁外层是由孢粉素构成的T字形结构和油脂类为主要成分的含油层组成。孢粉素是由多种化合物聚合形成的复合体,其成分复杂而又性质坚韧,对极端环境有极强的抗性。目前研究推测孢粉素的主要成分是长链脂类衍生物和芳香族化合物。近年来通过分子遗传学研究鉴定出几个参与孢粉素成分生物合成的基因,酯酰辅酶A合成酶ACOS5、细胞色素P450羟化酶家族成员CYP703A2与CYP704B1、查尔酮合成酶家族成员PKSA与PKSB、多聚α-吡喃酮还原酶TKPR1/2以及酯酰辅酶A还原酶MS2均参与了孢粉素成分的合成,并通过生化实验推测这些基因参与形成了一条孢粉素前体成分合成的路径。然而关于这些基因如何受到精确调控从而发挥各自生物学功能的研究,目前仅有少量且片面的研究。拟南芥花药绒毡层细胞为花粉壁的发育提供了原料,目前研究认为孢粉素前体成分是在绒毡层细胞内由上述基因编码的功能酶参与合成并转运至小孢子表面沉积形成花粉外壁外层结构。我们实验室发现一条存在于绒毡层细胞内的遗传调控通路DYT1-TDF1-AMS-MS188-MS1。MS188是MYB超级转录因子家族成员,ms188突变体花粉外壁外层T字形结构明显缺失,而外壁内层正常存在,暗示MS188可能参与调控孢粉素的生物合成。已报道bHLH家族转录因子AMS能够在体内结合PKSB和TKPR1的启动子,MS188能够与AMS相互作用共同调控并激活CYP703A2的表达。在本文中,我们首先通过构建孢粉素合成基因融合GFP标签序列的转基因植株,观察孢粉素合成功能酶的蛋白定位,发现孢粉素合成酶早期定位于绒毡层细胞,并随花药发育进入药室腔中,暗示孢粉素成分可能在药室腔中继续进行生物合成与加工,最终沉积于小孢子表面。随后我们分析了dyt1、tdf1、ams和ms188突变体植株花序的基因芯片数据,并以定量PCR实验辅助验证了孢粉素合成基因PKSA、PKSB、MS2和CYP703A2处于转录因子MS188下游,而ACOS5、CYP704B1、TKPR1和TKPR2处于AMS下游。通过染色质免疫共沉淀(ChIP)和凝胶迁移阻滞实验(EMSA)分别在体内和体外证明MS188能够结合在PKSA、PKSB、MS2、ACOS5和TKPR1启动子上,并且MS188同样能够在体内结合CYP774B1的启动子。进一步通过原生质体转化实验验证MS188能够激活PKSA、PKSB、MS2、TKPR1、ACOS5和CYP704B1的表达;然而AMS不能显著激活TKPR1和ACOS5的表达,对CYP704B1的激活能力明显弱于MS188,表明MS188是调控孢粉素合成基因的核心转录因子。AMS与MS188共同存在时,能够更强效激活CYP704B1和TKPR1的表达,结合前文AMS与MS 188共同激活CYP703A2表达的结果,我们推测MS188在AMS的辅助下共同调控了孢粉素的生物合成。进一步通过构建MS188-SRDX显性抑制转基因植株发现,在AMS的蛋白表达不受影响而MS188功能缺失时,ACOS5、CYP704B1和TKPR1/2的表达明显下调。在ams突变体中,当AMS功能缺失时,MS188的正常表达能够显著恢复PKSA、PKSB、ACOS5、CYP704B1和TKPR 的表达,而 MS2 的表达则与CYP703A2相同,仅得到部分恢复。这些结果暗示在绒毡层中还存在其他MYB与bHLH家族转录因子参与MS188和AMS对孢粉素合成基因的调控。我们通过酵母双杂交实验进行初步验证,发现bHLH010能够与MS188相互作用,这一结果支持我们的推测。基于以上实验结果,本文中我们论述了拟南芥花药绒毡层中可能存在以转录因子MS188为核心形成的多元转录因子复合体参与调控孢粉素合成基因表达的机制,以及AMS与MS 188可能形成feed forward loop模式快速调控孢粉素合成基因表达,随后孢粉素合成酶大量分泌进入药室腔促进孢粉素的快速生物合成的机制。这些机理的研究帮助我们更深入地理解绒毡层转录因子调控花粉壁形成的生物学过程,以及该过程在植物进化中对于植物完美保护自身花粉进而正常繁衍后代的重要意义。
【图文】：

拟南芥,雄蕊,花药,花粉囊

上海师范大学博士学位论文逦逡逑第１章前言逡逑１．１花药形态及其发育过程逡逑十字花科植物拟南芥是己经完成全基因组测序的经典模式植物，其典型的生逡逑殖器官逦花，是由四个基础部分组成：花瓣（ｐｅｔａｌ）、萼片（ｓｅｐａｌ）、雌蕊（ｐｉｓｔｉｌ）逡逑和雄蕊（ｓｔａｍｅｎ）（图丨－１，ａ）。雄蕊是种子植物产生花粉的场所，分为花丝（ｆｉｌａｍｅｎｔ）逡逑和花药（ａｎｔｈｅｒ）两个部分（图丨－１，邋ｂ）。花丝呈柄状，是由表皮与维管束构成，位逡逑于雄蕊基部，主要起到支撑花药并输送营养物质和水分的作用。花药是雄蕊中最逡逑重要的组成部分，外部呈四个叶状形态；内部则被药隔分成两个药室并各含１？逡逑２个花粉囊，由结缔组织连接并依附于花丝的维管束上。在花粉囊中，小孢子发逡逑生到花粉成熟要经过孢子体细胞层的分化，减数分裂，配子体发育等一系列过程，逡逑待花粉成熟时，花粉囊自行开裂，散出花粉＝逡逑

绒毡层,花粉外壁,小孢子,毡层

图１－３花粉壁发育中绒毡层的功能（Ｐｉｆｆａｎｅｌｌｉｅ／ａ／．，邋１９９８）逡逑Ａ：减数分裂后，，小孢子从四分体释放，绒毡层分泌小囊泡及油体等物质参与花粉外壁发育；逡逑Ｂ小孢子第一次有丝分裂期结束后，花粉外壁结构基本形成，绒毡层持续分泌各种营养物逡逑质以供给花粉发育；Ｃ绒毡层在发育晚期将自身降解形成的造油体及细胞质脂体提供给花逡逑粉；Ｄ花粉壁的油脂类结构。Ｔａｐｅｔｕｍ：纟戎毯层；Ｖｅｓｉｃｌｅｓ：囊泡；Ｎｕｃｌｅｉ：细胞核；ｐｌａｓｔｉｄ：逡逑质体；Ｖａｃｕｏｌｅ：液泡；Ｌｉｐｉｄｉｃ邋ｂｏｄｉｅｓ：含油体；Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ邋ｌｉｐｉｄ邋ｂｏｄｙ：细胞质脂体；Ｓｅｃｒｅｔｅｄ逡逑ｆｉｂｒｉｌｓ：分泌的纤维成分；Ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ邋ｃｅｌｌ：营养细胞；Ｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ邋ｃｅｌｌ：生殖细胞；Ｅｘｉｎｅ：花逡逑粉外壁；ｒＥＲ：粗面内质网；Ｅｌａｉｏｐｌａｓｔ：造油体；Ｏｉｌ邋ｂｏｄｙ：油体；Ｐｏｌｌｅｎ邋ｃｏａｔ：花粉包被。逡逑１．２．２绒毡层功能逡逑绒毡层在花药发育中起到不可替代的多重功能。首先，从小孢子的减数分裂逡逑开始直至绒毡层完全降解的过程中绒毡层细胞能够持续供给营养。当绒毡层细胞逡逑转入分泌型后其细胞质浓密，富含与合成及转运相关的细胞器，如内质网、液泡、逡逑质体、微体和脂质体等，并且能通过分泌小泡来转运脂类、蛋白质及碳水化合物逡逑等（Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓ，邋１９９０）。逡逑其次绒毡层能够合成构成花粉外壁外层的孢粉素前体、构成花粉外壁内层的逡逑
【学位授予单位】：上海师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943.2

【相似文献】