人腺样囊性癌融合基因GOLT1A-Kiss1的鉴定和功能分析

发布时间：2020-04-28 04:49

【摘要】：融合基因(fusion gene)是指两个基因的一部分或者全部序列互相融合形成的一个新的基因,它们共用同一套调控序列(即启动子、增强子、终止子等)。形成融合基因最常见的机制是染色体重排,其中包括染色体易位(translocation)、中间缺失(deletion)、反式剪切(trans-splicing)和倒位(inversion)等。融合蛋白是融合基因的表达产物。肿瘤转移(cancer metastasis)是指原发灶的肿瘤细胞通过淋巴管、血管或通过其他途径被带到其他部位继续生长,形成与原发部位相同类型的肿瘤的过程。一般肿瘤转移多在病期的后期发生,但对于肺癌、乳腺癌、甲状腺癌及前列腺癌等早期就可以发生肿瘤转移。现已有研究发现某些特异性融合基因产生的融合蛋白对肿瘤的发生和细胞的增殖起到促进作用。对于GOLT1A-Kiss1融合基因而言,是否它们的融合会对肿瘤的发生有着某种作用或怎样作用的,我们仍是不清楚的。目的:系统性的研究人涎腺腺样囊性癌转移过程中出现的特异性的基因融合事件并对其参与肿瘤转移的具体机制进行解释,并以此开发可用于临床早期诊断肿瘤转移的分子标记和提供今后可用于抑制肿瘤转移的药物靶点。方法:利用RNA-Seq高通量测序技术并结合生物信息学进行分析,确定与转移相关的融合基因,利用PCR和Sanger测序等技术对转移相关的融合基因进行融合基因的表达模式分析,并证实其特异性存在于高转移肿瘤细胞中;然后通过RACE等技术对融合基因的全长cDNA序列进行克隆,并用序列分析软件对其进行分析,后再用分子克隆技术构建GOLT1A-Kiss1融合基因以及Kiss1融合基因的相关表达载体;最后将构建好的载体利用瞬转的方法转入细胞中,并用Western blotting技术检测KISS1蛋白的表达情况,用双荧光素酶报告基因系统检测融合基因上游uAUGs对蛋白表达的影响。结果:通过PCR技术和Sanger测序确定GOLT1A-Kiss1基因融合事件的发生,并证实其特异性存在于SACC高转移细胞系ACC-M的肿瘤细胞中;通过RACE等技术将融合基因的全长c DNA序列克隆出来后发现了融合基因的三种融合方式;用分子克隆技术成功构建了pGL3-Fusion1-KISS1-GFP、p GL3-Fusion2-KISS1-GFP、pGL3-Fusion3-KISS1-GFP、pGL3-KISS1-GFP和Fusion1-Luc、Fusion2-Luc、Fusion3-Luc、KISS1-Luc以及其融合基因uAUGs全部突变后的载体;用PCR技术和Western blotting检测Kiss1基因的mRNA水平及内源性蛋白表达水平发现,其在高转移细胞系ACC-M中高mRNA水平低蛋白表达水平;双荧光素酶实验结果说明当把融合基因的uAUGs全部突变后荧光素酶活性上升。结论:GOLT1A-Kiss1的鉴定提供了一种新的基因融合的作用机制:即通过基因融合改变基因的5’UTR并抑制抑癌基因Kiss1的表达,从而激活癌症发生或推动肿瘤转移。同时,在包括涎腺腺样囊性癌、非小细胞性肺癌、乳腺癌和肝癌的多种肿瘤模型中,GOLT1A-Kiss1的表达和肿瘤的转移高度相关,其有希望作为多种肿瘤临床早期诊断及药物开发的新的靶点。
【图文】：

图 2.1 pMD18-T 载体图谱Figure 2.1 pMD18-T vector map是目的片段插入位置，序列如下所示：TGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCACTGCAGGTCGACGAT （ 目 的 片 段TAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGATTAATGAA按表 2.7 所示，，16℃连接 6h表 2.7 目的片段与 T 载体连接体系Table2.7 Fragment-T vector ligation system

照第二章中 2.2.2.3 中的 PCR 产物纯化方法进行便可。2.4.2 T 载体连接将纯化后的几种融合基因的全长 cDNA 按照表 2.7 的连接体系进行 T 载体，并按照 2.2.2.3 的方法进行鉴定和测序。其中鉴定时引物序列分别为 PGTGACCATGTACCAGCTGC ； P2 ： CTTTGGAACACTCCTGTAC ； P3TTATCGTGCTCCTACGC；P4: CTTGGTGAGAAGAGGCAGG，P1、P2 和 P游引物，P4 为下游引物，并以 ACC-M 的 cDNA 为模板。.3 实验结果与讨论.3.1 融合基因的鉴定及测序模 板 提 取 好 后 ， 利 用 我 们 事 先 设 计 的 引 物 GOLT1A-KISS1F1OLT1A-KISS1R1 来进行 PCR 扩增验证融合基因的存在。扩增结果如图 2.1 所
【学位授予单位】：湖北工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R730

【参考文献】

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本文编号：2643084