水稻生长素抑制基因OsARP1与Pid3介导的稻瘟病抗性关系的初步研究

发布时间：2020-04-29 01:53

【摘要】：生长素抑制蛋白(Auxin repressed protein,ARP)基因在植物界中分布广泛,且已被证实在一些植物的生长与防御以及种子休眠等过程中扮演重要的角色。但是,目前水稻生长素抑制基因Os ARP1的结构特征、表达特性以及生物学功能特别是与稻瘟病之间的关系尚未见报道。本文采用生物信息学方法,分析水稻Os ARP1及其功能相关基因的结构特点、启动子顺式作用元件、编码蛋白的结构特征;重点以感病品种TP309和转基因抗病品种TP309-Pid3为材料,研究稻瘟病菌感染过程中水稻Os ARP1及功能相关基因的表达水平,并采用转基因技术构建OsARP1基因CRISPR/Cas9敲除载体、RNAi载体和过表达载体,以获得转基因水稻,鉴定转基因水稻对稻瘟病菌的抗性。旨在初步了解水稻生长素抑制基因OsARP1与Pid3介导的稻瘟病抗性的关系。主要研究结果如下:1.通过对水稻生长素抑制基因Os ARP1及5个家族基因的生物信息学分析,发现OsARP1以及LOC_Os03g22270、LOC_Os08g35190、LOC_Os09g26620等4个基因编码蛋白的氨基酸序列中都含有生长素相关的结构域,其2kb的启动子区都含有水杨酸、脱落酸以及茉莉酸等防御激素类的顺式作用元件;这些基因编码蛋白没有被信号肽修饰,没有跨膜结构域,普遍存在着苏氨酸(T)、丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)磷酸化位点;Os ARP1基因编码蛋白预测作用场所在细胞质(可信度0.450),LOC_Os03g22270和LOC_Os09g26620编码蛋白的作用场所都在细胞质(可信度分别是0.650和0.600),LOC_Os08g35190基因的作用场所在细胞核(可信度0.650)。2.用稻瘟病菌Zhong 10-8-14接种感病水稻品种TP309和转基因抗病水稻品种TP309-Pid3,通过RT-PCR技术检测Os ARP1及LOC_Os03g22270、LOC_Os08g35190、LOC_Os09g26620等4个基因的表达量。结果显示,在感染稻瘟病菌后水稻OsARP1及其功能相关基因都能被诱导表达,其中OsARP1基因被诱导的幅度最大;与感病品种相比,抗病品种Os ARP1基因被诱导表达的速度更快、幅度更高。表明OsARP1基因在水稻对稻瘟病菌抗病信号通路中可能起重要作用。3.将敲除和沉默OsARP1基因的载体转化TP309和TP309-Pid3后,水稻愈伤组织生长缓慢,黄化严重,分化出的再生植株在没有形成根之前黄化最后死亡,很难获得再生植株。过表达Os ARP1基因的载体转化TP309后,大部分愈伤分化出的再生植株生命力太弱很难存活,仅获得了7株转基因植株。经过潮霉素抗性检测和OsARP1基因的表达量检测,发现有6株的表达量是下调,仅1株的OsARP1基因表达量上调。对表达量上调的转基因水稻接种稻瘟病菌后,发现过表达Os ARP1能增强水稻对稻瘟病菌的抗性。本文对OsARP1基因与水稻对稻瘟病菌抗性的关系进行讨论,初步认为Os ARP1基因与水稻对稻瘟病菌抗性之间有密切关系。同时对获得OsARP1基因敲除和沉默转基因植株的困难进行讨论。
【图文】：

过程图,组织培养,水稻,过程

水稻组织培养过程

孢子,荧光显微镜,孢子悬浮液,接菌

图 2.2 稻瘟病菌培养及荧光显微镜下观察孢子Fig.2.2 The spore of rice blast and fluorescence microscopy（2）稻瘟病菌的接菌方法：喷雾法和注射法a. 喷雾法：喷雾法一般我们是在水稻四叶期进行，首先将浓度为 5×104个/ml的孢子悬浮液，，按体积比 1000:1 的方法加入 20% Tween-20 附着剂，以增强孢子与水稻叶片的附着力，使孢子更好的附着在叶片上，再用喷壶均匀的喷洒使孢子悬浮液布满整个叶片，即完成接菌。b. 注射法：注射法我们通常在水稻分蘖期进行，首先将配置好的 5×104个/ml悬浮液，混匀后吸入普通的医用注射器。对水稻进行注射，我们先从茎中部将孢子悬浮液注入，注射器的针头必须在茎的中空部分，这样才能使孢子悬浮液成功注入到水稻组织中，约 1ml-2ml 的孢子悬浮液即可。若注射成功则孢子悬浮液会从茎的基部流入至顶部，然后悬浮液会从水稻茎杆顶部溢出，即完成接菌。对于表型的鉴定，我们是在接菌 7 天后观察水稻叶片的抗感情况。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S435.111.41

【参考文献】