应用玉米核糖体失活蛋白基因改善马铃薯对立枯丝核菌抗性

发布时间：2020-04-29 06:58

【摘要】：为探索在马铃薯中表达玉米源核糖体失活蛋白基因(RIP)是否可以改善受体对真菌病原立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的抗性,本研究以根癌农杆菌菌株LBA4404(p2301-RIP)转化马铃薯易感品种"Favorita"并进行了目的基因表达的分子生物学鉴定和对R.Solani的抗病性鉴定。结果表明:卡那霉素抗性再生株系的基因组中扩增到了目的基因,经Southern印记分析证实各独立转化株系基因组中均整合了2个拷贝RIP基因;RT-PCR分析表明RIP基因在转录水平正常表达;酶促活性测定表明部分转基因植株蛋白提取物具有RIP基因产物应有的脱嘌呤活性;温室盆栽试验证实有1个转基因株系显著提高了对由R.Solani引起的马铃薯黑痣病的抗性。
【图文】：

基因改善马铃薯对R.solani抗性的效果。1结果与分析1.1卡那霉素抗性株系RIP基因扩增利用含有重组质粒p2301-RIP的农杆菌LBA4-404侵染马铃薯基因型“Favorita”的叶圆片外植体，成功获得了卡那霉素抗性植株。以“Favorita”(“64”)基因组DNA为对照，利用RIP基因特异引物RIP-F和RIP-R对卡那霉素抗性株系试管苗叶片的基因组DNA进行PCR鉴定，结果表明：未转化对照“64”未扩增出特异条带，而所有转基因再生植株系增出了约925bp的特异片段(部分株系RIP基因PCR结果(图1)，初步证明外源基因已被转入到受体基因型Favorita中。1.2目的基因PCR阳性马铃薯株系Southern杂交鉴定Southern印记分析(以EcoRⅠ/HindⅢ消化马铃薯转基因株系及未转化对照基因组DNA,使用的杂交探针为是质粒为模板,对RIP基因PCR所获地高辛标记探针)表明：RIP基因整合到了供试转化株系基因组中。在这些转化体中，均检测到2条杂交带(图2)。图2展示了3个PCR阳性株系(FT-3,FT-4,FT-6)的Southern印记与由重组质粒RIP基因PCR产物dUTP标记探针的杂交结果。各有2条杂交带表明这些转基因株系中均插入了2个拷贝的RIP基因。杂交带的大小不同表明转化体中2个拷贝的RIP基因在其基因组中随机插入的位点也不同。RIP基因在由同一愈伤组织而来的再生株系(FT-3与FT-6)基因组中的整合模式相同，它们与来自另一个愈伤组织的株系(FT-4)整合模式则不相同。在未转化对照(64R)中未检测到目的基因。1.3转基因马铃薯RT-PCR检测提取部分Southern杂交阳性株系的RNA进行RT-PCR检测，结果显示，在以ef1-αF和ef1-αR为图1卡那霉素抗性株系RIP基因PCR鉴定

基因在转录水平得到表达。1.4RIP脱嘌呤活性分析按Tanpure等(2012)的方法测定荧光值后，对荧光值用DPS软件进行方差分析(表1)，结果表明：除FT-4荧光值与未转化对照“64R”差异不显著外，其他RT-PCR阳性转基因株系荧光值均极显著低于未转化对照“64R”，说明其RIP脱嘌呤活性均极显著高于未转化对照。1.5转基因株系块茎对R.Solani抗性鉴定根据对各株系块茎由R.Solani引起的黑痣病发生情况的调查结果，并对计算所得病情指数进行方差分析，，结果(表2)表明：由“Ⅱ”号愈伤组织上产生图2马铃薯品种“Favorita”的Southern印记分析注:M:地高辛标记分子标准物λ/HindⅢ(Roche);C-:未转化对照“64R”HindⅢ酶切消化产物(阴性对照);C+:质粒p2301-RIPDNA以EcoRⅠ酶切消化产物(阳性对照);3E和3H:目的基因PCR阳性株系FT-3分别以EcoRⅠ,HindⅢ酶解产物;4E和4H:目的基因PCR阳性株系FT-4分别以EcoRⅠ,HindⅢ酶解产物;6E和6H:目的基因PCR阳性株系FT-6分别以EcoRⅠ,HindⅢ酶解产物Figure2Southernblotanalysisofthecv.‘Favorita’Note:M:DIG-labeledmolecularweightmarkerλ/HindⅢ;C-:Non-transformedcontroldigestedwithHindⅢ;C+:Theplasmidp2301-RIPDNAtemplatedigestedwithEcoRⅠaspositivecon-trol;3Eand3H:Independenttransgenicclone‘FT-3’transformedwiththep2301-RIPandgenomicDNAdigestedwithEcoRⅠandHindⅢrespectively;4Eand4H:Independenttransgenicclone‘FT-4’transformedwiththep2301-RIPanddigestedwithEcoRⅠandHindⅢrespectively;6Eand6H:Independenttrans-

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