棉籽发育过程中脂肪酸组分及基因表达谱的差异分析

发布时间：2020-04-29 16:40

【摘要】：目的:棉花既是最重要的纤维作物,又是重要的油料作物。棉花的棉籽中含有25%~35%的棉籽油,是我国第五大食用植物油。作为食用植物油的重要来源,棉籽油的脂肪酸组分和营养功能越来越受到人们的重视。为了探明棉籽发育过程中不同脂肪酸的组成比例和相关性、相关基因的表达调控,以有利于定向改良棉籽油品质,本研究拟建立棉籽脂肪酸甲酯化的方法以及快速定量的方法,进而对棉籽发育过程中脂肪酸组分及基因表达谱的进行分析;为改良棉籽油品质提供科学基础。方法:以新疆本地两个棉花品种“新陆早39”与“新陆早50”的棉籽为材料,利用索氏提取仪提取其总油脂,分别采用三种常用的脂肪酸甲酯化方法:KOH-甲醇法,H_2SO_4-甲醇,14%BF_3-甲醇法进行甲酯化后,GC-MS上机分析;通过37种脂肪酸甲酯混标制定标准曲线,用外标法准确定量;从而建立棉籽脂肪酸甲酯化的方法以及快速定量的方法。以棉花品种“新陆早33号”为材料,通过GC-MS测定花后5-60天(DAF)的12个不同发育阶段棉籽的样品,分析棉籽脂肪酸发育过程中,各脂肪酸组分含量动态变化及其相关性。利用RNA-Seq技术对不同发育阶段棉籽的样品进行数字基因表达谱分析,分析脂肪酸组分与相关基因表达的相关性。结果与结论:1.过对新疆本地两个棉花品种“新陆早39”与“新陆早50”的棉籽进行总油脂提取,分别采用三种常用的脂肪酸甲酯化方法进行甲酯化,结果表明,KOH-甲醇法甲酯化的脂肪酸GC-MS上机分析能检测到10种棉籽的主要特征性脂肪酸;H_2SO_4-甲醇与14%BF_3-甲醇法只能检测到6种脂肪酸。且KOH-甲醇法操作简便,所以适用于棉籽脂肪酸的甲酯化。GC-MS测定表明,棉籽油脂肪酸以多不饱和脂肪酸的亚油酸为主,其次是饱和脂肪酸的棕榈酸以及单不饱和脂肪酸的油酸。在“新陆早39”以及“新陆早50”中,每克棉籽中亚油酸的含量分别达147.29mg与163.2mg,分别占其油脂含量的60.12%与60.23%;棕榈酸含量分别为65.05mg与62.28mg,分别占其油脂含量的26.55%与23.24%。油酸含量分别为24.79mg与22.19mg,分别占其油脂含量的8.28%和10.12%。2.在5DAF的棉籽中我们一共检测到了13种脂肪酸组分。其中含量较高为饱和的棕榈酸(C16:0),含量达33.96%,硬脂酸(C18:0)含量为9.02%,单不饱和的油酸(C18:1)含量为23.42%,多不饱和的亚油酸(C18:2)与亚麻酸(C18:3)含量分别为20.30%、7.44%。在种子的成熟期(60DAF),脂肪酸组分C16:0、C18:0、C18:1、C18:2与C18:3含量分别为22.35%、2.31%、15.59%、57.62%和0.02%。饱和脂肪酸的C16:0、C18:0和多不饱和脂肪酸C18:3,合成主要集中在授粉后前15天。单不饱和的C18:1和多不饱和的C18:2的合成主要集中在种子发育的中后期。饱和脂肪酸C16:0、C18:0与多不饱和脂肪酸C18:2相互制约、此消彼长。伴随着C18:1和C18:2的上升,其余几种脂肪酸均呈现明显下降的趋势。从脂肪酸组分的相关性分析来看,油酸(C18:1)和亚油酸(C18:2)呈同步积累,相互之间正相关显著;与C18:3、C16:0呈负相关。C18:0与C18:1,C18:3正相关,与C18:2负相关。C18:1的含量的增加,C18:2含量也会增加,而同时则导致C18:3含量的减少。在棉花种子发育过程中,C18:1与C18:2是影响棉花脂肪酸含量最主要因子。3.通过基因表达谱差异分析,结果表明在棉籽发育初期5 DAF以及棉籽发育晚期55DAF,60 DAF差异表达基因数目最多,5 DAF与0 DAF(子房)相比,上调基因数目为5709个,下调基因数目为6454个。棉籽发育晚期60 DAF与55 DAF相比,上调基因数目为5169个,下调基因数目为4256个。在棉籽发育中期基因差异数目较少。通过差异基因聚类分析表明,在棉籽发育5~25 DAF上调基因较多,在30~60 DAF下调基因较多。通过差异基因GO富集分析与Pathway富集分类分析我们可以发现,在棉籽发育早期涉及脂肪酸生物合成,脂肪酸代谢过程与角质和蜡的生物合成。4.在棉籽发育早期,当C16:0与C18:0积累超过一定域值时便诱导FAD2基因表达量提高,从而使C18:2大量合成。在20DAF开始,FAD2基因的表达量显著增大,从而亚油酸(C18:2)含量在20DAF明显增加;到40DAF时,FAD2基因表达量达到最大。亚麻酸(C18:3)含量发生变化主要在棉籽发育早期5DAF~15DAF,在此期间亚麻酸含量不断降低。通过对棉籽发育过程中的基因表达谱分析表明,FAD3基因在5DAF高水平表达,随后显著下降;在25 DAF时,FAD3基因水平仍明显下降,随后保持着很低的表达水平。总体来看,在棉籽发育过程中,脂肪酸合成关键酶的基因表达水平对合成脂肪酸组分的含量起重要的调控作用。植物体中各种脂肪酸积累模式的形式并非偶然,而是与植物体自我防御以及对后代的保护机制密切相关。有关脂肪酸代谢相关基因表达与脂肪酸累积的互作关系及作用机制仍有待于进一步的研究。
【图文】：

流程图,流程图,测序

测序流程图

脂肪酸甲酯,混合标准,总离子流,样品

图 3-1 37 种脂肪酸甲酯混合标准样品总离子流图Fig.3-1 Total ion current of a standard mixture of 37-component fatty acid methyl esters byGC-MS表 3-1 37 种脂肪酸甲酯混合标准样品的 GC-MS 定性结果Table 3-1 Composition, retention times and fragment ions of the standard mixture of37-component fatty acid methyl esters by GC-MS
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S562

【参考文献】