转cry1Ab和epsps基因抗虫耐除草剂玉米分子特征分析及检测方法研究

发布时间：2020-04-29 19:16

【摘要】：随着转基因作物商业化生产以来,种植面积不断扩大,关于转基因食品的生物安全性争议成为热点问题,受到国内外的广泛关注。转基因玉米是最早获得商业化种植的转基因作物之一,也是世界上种植面积最大的转基因经济、粮食作物。玉米作为我国的主要粮食之一,同时也是研究较多的模式植物。本文以转cry1Ab和epsps基因抗虫耐除草剂玉米为材料,通过确定该转基因玉米的外源插入片段全序列、插入位点、侧翼序列和拷贝数等信息,为转基因玉米的安全评价提供分子特征方面的依据。研究结果表明:1.明确了转cry1Ab和epsps基因抗虫耐除草剂玉米的分子特征信息(1)通过常规PCR技术,对插入元件进行检测。基于长链PCR原理,利用高保真酶对插入片段侧翼序列进行测定。经PCR扩增和测序结果分析,确定了插入序列的全长为12499 bp,转入序列插入于玉米Chr01染色体,第271,871,046位点上。(2)利用Southern bloting和微流滴数字PCR两种方法对转基因抗虫耐除草剂玉米外源插入序列的拷贝数进行测定,确定了目的基因为单拷贝。2.建立了转cry1Ab和epsps基因抗虫耐除草剂玉米的转化体特异性定性PCR方法以转化体特异性序列为靶标,设计了特异性引物,并对特异性、反应体系、反应程序进行了优化和确定。主要为:(1)采用常规PCR方法,确定了转cry1Ab和epsps基因抗虫耐除草剂玉米特异性引物,上游引物为5'-CAGTACTAAAATCCAGATCCCCCGA-3',下游引物为5'-CAGACGACGGTCCGCTAA-3',预期扩增片段大小为259 bp。(2)采用常规PCR方法,确定了最合适的引物浓度为0.4μmol/L,退火温度为58℃。(3)采用常规PCR方法,确定了特异性良好的检测方法,检出限为0.1%,满足转基因生物安全检测监管的需求。
【图文】：

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83 年，美国诞生了全世界首例转基因烟草，随后又成功繁育出转基因ryski P et al.1983）。1996 年，转基因作物开始进行全球商业化应用，截经有 26 个国家种植了 1.851 亿公顷转基因作物，比 2015 年的 1.797 亿万公顷，即增加了 3%，除 2015 年以外，这是第 20 个增长年份。最近技术无疑为育种家们研制新的具有良好优良性状的作物提供了一种新着转基因技术在农业领域的的大量应用，世界各国对转基因作物的看愈多，因此转基因作物对人畜环境潜在的风险也是我们必须考虑的。国是全球范围内开放转基因作物商业化种植最早和转基因作物种植面2016 年美国转基因作物的种植面积达到 7 290 万公顷，其次为巴西(4根廷( 2380 万公顷)、加拿大(1160 万公顷)和印度(1080 万公顷) (如的种植面积为 1．682亿公顷，占全球种植面积的 91%（James C2016）

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表 2-1 zSSIIb 基因定性 PCR 扩增体系试剂Reagent、。体积Volume2×Green Master Mix 25 μL正向引物-F 2 μL反向引物-R 2 μLDNA 4 μLddH2O 17 μL总体积 50 μL扩增程序如下：94 ℃变性 5 min；94 ℃变性 30 s，58 ℃退火 30 s，，72 ℃延伸 30s，共进行 35 次循环；72 ℃延伸 5 min；10 ℃保存；扩增结束后使用电泳检测。2.2.3 转基因元件筛选检测2.2.3.1 常见转基因元件筛选根据查询相关文献获得的信息，初步绘制出转基因抗虫耐除草剂玉米的构建线性图，包括了各个插入元件（外源基因、标志基因、启动子、内含子、终止子等）的位置。构建线性图示意图如图 2-1 所示。
【学位授予单位】：天津农学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S513

【参考文献】