Aldh4a1基因在斑马鱼胚胎早期发育中的作用及Cldn7基因的敲除

发布时间：2020-04-29 20:31

【摘要】：视黄酸(retinoic acid,RA)是一种内源信号分子,通过与核受体RAR(retinoic acid receptor)及RXR(retinoic acid receptor)结合发挥其调控作用,视黄酸信号途径异常会引起先天性疾病如心脏病、神经系统缺陷及身体畸形等。据文献报道,乙醛脱氢酶 1a(Aldehyde dehydrogenases 1A,Aldh1a)家族中Aldh1a1、Aldh1a2、Aldh1a3、Aldh1a4基因产物都具有视黄醛脱氢酶的功能,参与视黄酸在体内的生物合成。但乙醛脱氢酶 4a1(Aldehydedehydrogenases4a1,Aldh4a1)是否具有视黄醛脱氢酶的功能未见报道,仍待探究。本论文取得以下结果:(1)运用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼Aldh4a1,并筛选得到移码突变(-5bp)的纯合突变体F2代,产生编码143个氨基酸的截短蛋白。(2)用RT-PCR及qRT-PCR研究Aldh4a1在野生斑马鱼早期胚胎各个时期及成体各组织器官的表达情况,结果表明其为母源表达,随着时间的推移mRNA量逐渐下降,在发育到24h时合子基因表达量达到高峰,且在精巢、肌肉表达量较高,在卵巢及其他组织器官中表达较低。(3)Aldh4a1杂合F1代突变体互交,部分F2斑马鱼在发育到第四天左右时死亡,单个提取死亡的斑马鱼的基因组并检测其基因型,发现都是Aldh4aI-/-纯合突变体,统计结果显示其占所有F2代胚胎的25%,随机检测正常表型的胚胎,其基因型为野生型或杂合体,未见突变纯合体。证明Aldh4a1为隐性致死基因。(4)观察Aldh4al纯合突变体表型,发现心包囊肿,其头部眼部变小,体节变短弯曲,色素变少,形态异常。(5)原位杂交表明心室特异性肌球蛋白重链基因vwhc(ventricular myosin heavy chain)在36hpf Aldh4a1纯合突变体心室的表达向后方扩展,且在心前区位置表达量增加,心房特异性肌球蛋白重链基因amhc(atrial myosin heavy chain)在36hpf Aldh4a1纯合突变体心房的表达量降低且表达范围减少,显示心脏发育异常。(6)于显微镜下统计Aldh4a1-/-心率,发现其心率较野生型明显降低,血液循环减弱。(7)原位杂交表明HuC在48hpf斑马鱼大脑中的表达量明显降低,且在其后脑位置表达量降低最为显著,显示大脑发育异常。(8)将72hpf的Aldh4a1纯合突变体和72hpf野生型斑马鱼于显微镜下,给予相同的外界刺激,发现Aldh4a1纯合突变体不能对外界的刺激做出反应,应激反应基本消失。(9)原位杂交共定位以myod(myogenic differentiation)标记体节,以krox20标记菱脑节3及菱脑节5,在Aldh4a1纯合突变体中显示菱脑节5和第一体节之间的距离相对缩短。(10)阿尔新兰染色分析表明,Aldh4a1纯合突变体的咽弓软骨发育异常,其中下颌弓以及腭方软骨完全消失,舌骨弓体积减小,且没有胸鳍。(11)视黄酸补偿实验表明,外源性添加一定剂量的视黄酸,Aldh4a1纯合突变体的异常表型消失,证明了Aldh4a 也是一种是视黄醛脱氢酶,参与视黄酸的生物合成过程。本论文还运用CRISPR/Cas9技术敲除Cldn7基因,拟研究其对雄性斑马鱼生殖的影响。得到-4bp的Cldn7b杂合突变体。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q344

【参考文献】