马氏珠母贝棱柱层相关基质蛋白基因的克隆及功能研究

发布时间：2020-04-30 06:00

【摘要】：贝壳基质蛋白(Shell Matrix Proteins,SMPs)是贝壳形成的主要参与者和功能执行者,在有机框架构建和矿物沉积过发挥重要作用。本课题组前期通过对马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)贝壳基质蛋白质组分析,获得了棱柱层SMPs。本研究对其中的5个SMPs基因进行全长克隆,并通过q RT-PCR、原位杂交(ISH)、RNAi和原核表达技术进行功能验证。结果如下:1、β-N-乙酰-己糖胺酶(Beta-hexosaminidase/Beta-N-acetylhexosaminidase,HEX)属于糖苷水解酶20家族(GH20),是几丁质代谢的关键水解酶。几丁质作为有机框架主要成分,其代谢在贝壳矿化中发挥重要作用。本研究克隆获得2个β-N-乙酰-己糖胺酶基因Pm HEX和Pm HEXL。Pm HEX全长3 813 bp,编码1 141个氨基酸;Pm HEXL全长2 760bp,编码774个氨基酸;二者均含有两个典型的GH20和GH20b结构域和一个碳水化合物结合结构域(CHB-HEX)。QRT-PCR分析表明Pm HEX和Pm HEXL在外套膜边缘区(ME)和套膜区(MP)均显著高表达,ISH检测显示Pm HEX和Pm HEXL均主要定位于边缘区外褶和套膜区的外侧上皮细胞。RNAi干扰后,Pm HEX在外套膜边缘区和套膜区的表达量均显著下调(P0.05);且贝壳棱柱层和珍珠层微观结构都出现不同程度的紊乱。因此,Pm HEX参与了贝壳棱柱层和珍珠层的形成。2、几丁质结合蛋白在与几丁质特异性结合、钙化调控等过程发挥重要作用。通过克隆获得马氏珠母贝几丁质结合蛋白(Chitin binding protein,CBP)Pm CBP基因全长序列6 367 bp,编码2 044个氨基酸,包含20个典型的Cht BD2结构域(CBDs),且Cht BD2结构域在物种间具有较高的保守性。QRT-PCR分析表明Pm CBP在外套膜套膜区表达量最高(P0.05);ISH分析显示Pm CBP基因主要分布于外套膜套膜区外侧上皮细胞。RNAi干扰后,Pm CBP在外套膜套膜区的表达量显著下调,且贝壳珍珠层结构生长紊乱。相关性分析发现Pm CBP的表达水平与壳重和壳长呈正相关(P0.05)。因此,Pm CBP参与了贝壳珍珠层的形成。3、本研究克隆获得马氏珠母贝含表皮生长因子样结构域的蛋白(Epidermal growth factor-like domain-containing protein,EGFCP)Pm EGFCP(PU12)基因全长1 394 bp,编码363个氨基酸,具有2个保守的表皮生长因子样结构域(Epidermal growth factor-like domain,EGF)、一个透明带结构域(Zona pellucida domain,ZP)。QRT-PCR分析表明Pm EGFCP在外套膜边缘区和套膜区著高表达(P0.05);ISH检测显示Pm EGFCP主要定位于边缘区外褶外侧和中褶内侧以及套膜区外侧上皮细胞。RNAi干扰后Pm EGFCP在边缘区的表达量显著下调,且贝壳棱柱层结构生长紊乱,珍珠层正常。因此,Pm EGFCP参与了贝壳棱柱层的形成。通过构建p ET32a-Pm EGFCP的原核表达载体,成功诱导表达了Pm EGFCP重组蛋白,Western blot检测其带有His标签,且与预测分子量大小一致。经复性浓缩冻干获得3mg的Pm EGFCP重组蛋白。4、本研究克隆获得马氏珠母贝没有功能注释的壳基质蛋白基因Pm-PNU7全长序列797 bp,编码145个氨基酸,具有特殊的“KGG”重复序列和富含天冬氨酸(Asp)序列“DDDDDDHDD”。QRT-PCR分析表明Pm-PNU7基因在外套膜边缘区和套膜区显著高表达(P0.05);ISH检测显示Pm-PNU7主要定位于边缘区外褶外侧和内侧上皮细胞、中褶内侧上皮细胞以及套膜区外侧上皮细胞。RNAi干扰后,Pm-PNU7在外套膜边缘区和套膜区的表达量均显著下调,贝壳棱柱层和珍珠层微观结构均出现不同程度的紊乱。因此,Pm-PNU7参与了贝壳棱柱层和珍珠层的形成。
【图文】：

氨基酸序列,蛋白质结构,结构域,海洋大学

广东海洋大学硕士学位论文图2-1 PmHEX的cDNA及氨基酸序列分析注：5’和 3’非编码区用小写字母表示；编码区以及推导的氨基酸序列用大写字母表示；方框内的“ATG”和“TAG分别为起始密码子和终止密码子；黑色背景部分表示跨膜结构域；阴影部分为碳水化合物结合结构域；虚线部分为 GH20b 结构域；单划线部分为 GH20 结构域Fig 2-1 The sequence analysis of cDNA and amino acid of PmHEXNote: 5’ UTR and 3’ UTR are indicated with small letters; Open reading fragment and the deduced amino acid sequenceare indicated with capital letters; “ATG”and “TAG” with a frame represents the initiation codon and stop codon; Thesequence in black background is the transmembrane region; The sequence in gray background is CHB-HEX domain; Thdashed underlined letters represents the Glyco_hydro_20b domain; The single underlined sequence represents theGlyco_hydro_20 domain

结构域,蛋白质结构,信号肽,蓝色

为 GH20b 结构域；单划线部分为 GH20 结构域Fig 2-1 The sequence analysis of cDNA and amino acid of PmHEXand 3’ UTR are indicated with small letters; Open reading fragment and the deduced amin with capital letters; “ATG”and “TAG” with a frame represents the initiation codon and sck background is the transmembrane region; The sequence in gray background is CHB-Herlined letters represents the Glyco_hydro_20b domain; The single underlined sequence rGlyco_hydro_20 domain图2-2 SMART 预测的PmHEX蛋白质结构EX：碳水化合物结合结构域；Glyco_hydro_20b和Glyco_hydro_20：糖族催化结构域；蓝色区域是信号肽Fig 2-2 PmHEX protein structure was predicted with SMART softwarEX: Putative carbohydrate binding domain; Glyco_hydro_20b and Glyco_hydro_20: Gly20 family catalytic domain; The blue region is a transmembrane domain
【学位授予单位】：广东海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4

【参考文献】