中国水仙花转录组分析及类黄酮代谢MYB基因功能研究

发布时间：2020-04-30 06:43

【摘要】：中国水仙(Narcissus tazetta var.chinensis)是我国十大传统名花,观赏价值较高。然而水仙花色单调、品种单一,至今中国水仙品种仍较少。深入研究中国水仙花色形成的分子机制,进行分子改造,将是中国水仙花色创新和新品种培育的有效途径。本研究以漳州水仙为材料,通过水仙花瓣和副冠转录组测序分析,筛选出参与调控类黄酮合成途径的R2R3-MYB转录因子,进行表达分析及功能验证,为中国水仙花色形成机理的研究提供理论基础。本研究主要获得以下研究成果:1.本试验以漳州水仙'金盏银台'为实验材料,提取始花期花朵(花瓣和副冠混合)RNA,用IlluminaHiseq 2000进行高通量测序,共获得 23,081,029 条total clean reads,组装后共获得 55,418 条 unigene,其中超过500的unigene有21,750个,长度在1kb以上的unigene有11,053 条,unigene 平均读长 669bp,N50 读长 1,049bp。对 Unigene进行功能注释,包括与 NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、GO和Pfam数据库的比对,共获得32,414条Unigene的注释结果,从而构建了水仙花转录组数据库。进行基于Unigene库的基因结构分析,其中SSR分析共获得3,276个SSR标记。将花转录组与之前测序的鳞茎盘转录组进行分析,共得到7,059个差异表达基因(DEGs),其中3,663个DEGs上调表达,3,396个DEGs下调表达,差异表达基因被注释到126个KEGG代谢通路。2.通过花转录组与鳞茎盘转录组差异表达基因分析,获得2个与类黄酮代谢相关的R2R3-MYB转录因子。初步序列分析表明其中一个与花青素合成抑制有关,命名为NtMYB7;另一个与类黄酮合成激活有关,命名为NtMYB8。3.从漳州水仙中克隆出NtMYB7和NtMYB8编码区全长序列,开放阅读框(ORF)分别为753bp、803bp,分别编码250和268个氨基酸。NtMYB7和NtMYB8的GenBank登录号为MF522208和MF522209。蛋白多重序列比对分析发现NtMYB7、NtMYB8基因都含有R2和R3保守结构域,属于R2R3-MYB基因;系统进化树分析结果显示NtMYB7与花青素合成抑制因子聚为一类,NtMYB8与花青素合成激活因子聚为一类。通过对NtMYB7、NtMYB8在中国水仙不同花期花瓣和副冠以及不同器官的表达,发现NtMYB7表达量在鳞茎盘中表达量最高,表达量是花苞期花瓣表达量的近20倍;在花瓣中,NtMYB7基因的相对表达量随着水仙花的开放逐渐升高,盛花期达到最高;在副冠中,始花期表达量最高,花苞期和盛花期表达量较低。NtMYB8在花中的表达量高于鳞茎盘和叶片,花苞期副冠中NtMYB8的表达量是鳞茎盘的近17倍,随着花的开放,NtMYB8在副冠中的表达量显著下降。4.构建 pSAK277-NtMYB7 和 pSAK277-NtMYB8 植物表达载体,并转化农杆菌,进行烟草瞬时表达实验。在烟草瞬时表达中,定量PCR分析表明NtMYB7显著抑制烟草黄酮醇代谢分支FLS基因的表达,同时抑制StMYB激活的花青素和原花青素合成结构基因的表达。研究结果初步判断NtMYB7是中国水仙类黄酮代谢途径的抑制因子。单独注射NtMYB8基因烟草叶片没有变化,NtMYB8基因与StBHLH混合注射,定量结果显著上调FLS、LAR和ANS基因的表达,NtMYB8可能与StBHLH结合促进黄酮醇、原花青素以及花青素的合成。但是NtMYB8在水仙的花中表达量最高,所以推测它在中国水仙中,特别是副冠中可能同时激活黄酮醇、原花青素和花青素的合成,但是由于水仙与烟草不同,在水仙中是否激活黄酮醇代谢途径,还有待进一步验证。5.通过NtMYB7基因、NtMYB8基因稳定转化烟草,获得了转基因植株,烟草开花表型分析发现,转基因花色颜色变浅,进一步推测NtMYB7基因可能抑制了花青素代谢途径,导致颜色变浅;NtMYB8基因可能主要促进黄酮醇分支,从而与花青素分支竞争,导致烟草花色变浅,其基因功能需要后续实验进一步验证。
【图文】：

黄酮醇,生物合成途径,黄酮

（４）鞋酐（Ｐｈｌｏｂａｐｈｅｎｅｓ）途径；（５）原花青素（Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙｎｉｄｉｎｓ）途径；（６）花逡逑青素（Ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ）途径；（７）橙酮（Ａｕｒｏｎｅｓ）途径［１７］。逡逑类黄酮合成途径如图１－１，类黄酮色素的前体物质是苯丙氨（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ），逡逑其合成途径由多种结构基因和调节基因控制。首先，类黄酮代谢途径为由苯丙氨逡逑酸裂解酶（ＰＡＯ催化苯丙氨酸形成肉桂酸，再经肉桂酸径化酶（Ｃ份）和香豆逡逑酞ＣｏＡ连接酶ＵＣＺ）的催化作用形成４－香豆素－ＣｏＡ，接着在查儿酮合成酶逡逑Ｃ／对（Ｃｈａｌｃｏｎｅ邋ｓｙｎｔｈａｓｅ）的作用下生成查儿酮；其中香豆酰ＣｏＡ来源于苯丙炼逡逑途径（Ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄ邋ｐａｔｈｗａｙ），丙二酰ＣｏＡ来自乙憸ＣｏＡ［１８］；接着，以查尔逡逑酮为底物并在查耳酮异构酶Ｃ７／／（Ｃｈａｌｃｏｎｅｉｓｏｍｅｒａｓｅ）的作用下生成黄酮；之后黄逡逑酮在黄酮醇－３－轻化酶（Ｆａｖｏｎｏ３－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ邋）和黄酮醇－３’－轻化酶逡逑’／／（Ｆｌａｖｏｎｏｌ邋３’－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）的作用下形成二氢黄酮醇，在二氢黄酮醇４－还原酶逡逑ｉ＾Ｐ＾Ｄｉｈｙｄｒｏｆｌａｖｏｎｏｌ邋４－ｒｅｄｕｃｔａｓｅ邋）和黄酮醇合成酶邋ＦＬＳ（Ｆｌａｖｏｎｏｌ邋ｓｙｎｔｈａｓｅ）作用下逡逑生二氢黄酮醇分别生成花青素和黄酮醇；原花青素原花青素还原酶逡逑Ｕｉ？（Ｌｅｕｃｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ邋ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）的催化作用下生成儿茶素，花青素在花青素还逡逑原酶逦Ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ邋ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）催化下形成表儿茶素［

不同时期,水仙,转录组,实验材料

。分析，我们能在宏观水平上检测物种转录本的结构和表达量。本部分实验主要以逡逑水仙始花期的花朵为实验材料，基于Ｉｌｌｕｍｉｎａ邋ＨｉＳｅｑＴＭ邋２０００进行转录组高通量逡逑测序。前期研究发现，中国水仙花中黄酮类物质主要是黄酮醇，淲茎盘中主要黄逡逑酮类物质是原花青素％因此本研宄将花转录组数据与前期获得的淲茎盘转录组逡逑数据对比分析，，筛选出类黄酮合成途径参与调控结构基因的相关转录因子，逡逑为进一步分析水仙类黄酮代谢途径的调控机制和中国水仙花色研究奠定基础。逡逑１实验材料逡逑１．１植物材料逡逑以漳州水仙‘金盏银台’（白色花瓣和黄色副冠）为实验材料，水仙的成花过逡逑程分为３个时期，转录测序以水仙始花期的花朵为实验材料。取水仙种球，剥去逡逑最外层鳞片，放入水中培养至开花后，取始花期的花瓣和副冠（去掉花丝、花药逡逑和花柱）混合后置于离心管中，用液氮速冻，立即放入－８０°Ｃ冰箱中贮存备用。逡逑
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943.2;S682.21

【参考文献】