反义长链非编码RNA POSH2-AS1调控编码基因POSH2在肺癌中的作用及机制研究

发布时间：2020-04-30 09:35

【摘要】：研究背景:肺癌是常见的恶性肿瘤之一,近年高居癌症所致的死亡原因首位,严重危害人类健康,对世界范围公共卫生慢性非传染性疾病防治发起了严峻的挑战。根据最新版的《美国癌症统计》,在2018年,美国预计有二十三万人发病,并预估有十五万人将死于肺癌。在世界范围内,每年有一百八十万人被诊断为肺癌,并导致一百六十万人死亡。在我国,根据2015年发布的中国癌症统计年报显示,2015年全国预计新发肺癌病例数为73.3万人,占新发肿瘤的17%,而预计肺癌致死人数将达到61.0万人,占肿瘤死因人数的21.7%。由于诊断上的困难以及治疗策略局限,不同地区和国家肺癌病人五年生存率在4-17%之间,仍处于较低水平。因此,寻找有价值的肺癌诊断的分子生物标志物及潜在的基因治疗靶点是近来肺癌领域的研究重点,探索影响肺癌发生发展的基因表达及其分子功能及机制是肺癌研究的当务之急。近年来,一些在肺癌的发生发展中起着重要调控作用的新型分子被逐渐发现。长链非编码RNA是一种长度超过两百个核苷酸,缺乏蛋白编码能力的RNA转录本。长链非编码RNA在表观遗传水平、转录水平、转录后水平均可发挥重要的调控作用,参与多种重要的生物学功能。长链非编码RNA按基因定位大致可分为:正义链长链非编码RNA(Sense lncRNAs)、反义链长链非编码RNA(Antisense lncRNAs)、双向长链非编码RNA(Bidirectional lncRNAs)、基因间长链非编码RNA(Intergenic lncRNAs)及基因内长链非编码RNA(Intronic lncRNAs)。反义长链非编码RNA是长链非编码RNA的一种,其同时也属于天然反义转录本(Natural antisense transcripts)的一种亚类,在哺乳动物中含量丰富,有多样的生物功能调节机制,并以此来发挥广泛的生物学功能。研究显示,反义长链非编码RNA常富集于编码基因的起始端或者末尾端,主要用其与编码基因天然配对的反义链或其他机制调控临近或者远端的编码基因表达。在肿瘤生物学中,反义长链非编码RNA的突变或异常表达与肺癌进展相关,如上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition)、肿瘤增殖、侵袭及远端转移等。与此同时,许多癌症相关的反义长链非编码RNA被逐渐发现,例如HOX反义RNA(HOTAIR)、肌动蛋白丝相关蛋白1反义RNA1(AFAP1-AS1)、FEZ家族锌指蛋白1反义RNA1(FEZF1-AS1)等。因此,近来的研究已表明反义长链非编码RNA对肿瘤调控具有重要意义,然而,目前研究对反义长链非编码RNA在肺癌中的表达情况及其如何调控肺癌的发生发展的细胞功能和分子机制还有待进一步探索。课题组前期发现多篇文献报道染色体2q12-13区段内等位基因缺失、单核苷酸多态性等与多种肿瘤及疾病相关,此区段内含有包括NPHP1、LIMS3、LIMS1、SEPT10、Linc0016等10个基因,我们通过小样本实验发现位于染色体2q12.3的反义长链非编码RNA POSH2-AS1(Plenty of SH3 domin family 2 antisense RNA1)在肺癌组织中呈低表达。在基因位置上,POSH2-AS1与含有多个Src同源3结构域(Src homolog 3 domain,SH3 domain)编码基因POSH2(Plenty of SH3domin family 2,POSH2)的上游核心启动子区及其第一个外显子碱基序列反向天然互补配对。因此,课题组拟假设反义长链非编码RNA POSH2-AS1与肺癌发生发展相关,并拟通过扩大样本量检验POSH2-AS1在肺癌中的表达情况,构建POSH2-AS1高表达和低表达细胞模型,研究其肿瘤细胞生物学功能,通过生物信息学分析POSH2-AS1其潜在调控靶基因,探索其在肺癌发生发展中的功能及可能的作用机制,为肺癌的诊断和治疗提供科学依据。目的:探讨反义长链非编码RNA POSH2-AS1在肺癌中的表达模式、肿瘤生物学功能及机制。方法:1.在课题收集的共209例新诊断的华南及华东肺癌病例肺癌组织及癌旁正常肺组织样本中检测POSH2-AS1表达水平,并分析其在肺癌中的表达情况与肺癌病例临床特征的关系。2.构建POSH2-AS1高表达和低表达人肺癌细胞系A549及PC-9模型以及相应的对照模型;采用CCK-8实验研究POSH2-AS1高表达、低表达对肺癌细胞系的增殖能力影响;采用平板克隆实验研究POSH2-AS1高表达、低表达对肺癌细胞的增殖能力和群体依赖性的影响;采用流式细胞仪研究POSH2-AS1高表达、低表达对肺癌细胞的周期和凋亡的影响;采用细胞迁移及侵袭实验研究POSH2-AS1高表达、低表达对肺癌细胞的迁移能力和侵袭能力的影响;采用裸鼠成瘤实验研究POSH2-AS1高表达、低表达对肺癌细胞体内成增殖成瘤能力的影响;采用肿瘤细胞裸鼠尾静脉注射实验研究POSH2-AS1高表达、低表达对肺癌细胞的体内转移能力的影响。3.在课题收集的肺癌组织及癌旁正常组织样本中检测POSH2-AS1潜在靶基因的表达水平,并研究其与POSH2-AS1的关系;利用构建的POSH2-AS1高表达、低表达肺癌细胞系模型研究POSH2-AS1的表达变化对潜在靶基因表达的影响;采用荧光素酶报告基因研究POSH2-AS1对靶基因表达的直接调控机制;构建的POSH2-AS1高表达、低表达肺癌细胞系模型中,采用siRNA敲低靶基因表达,进一步研究其调控机制。结果:1.通过q-RT PCR检测POSH2-AS1表达水平,结果显示,与癌旁正常肺组织相比,POSH2-AS1在肺癌组织中呈低表达(P=0.004)。2.POSH2-AS1低表达与肺癌临床分期(I+II vs.III+IV,P=0.003)、原发灶大小(T1+T2 vs.T3+T4,P=0.001)存在关联。3.在POSH2-AS1高表达和低表达A549及PC-9肺癌细胞系模型中进行CCK-8细胞增殖实验显示,在两组细胞系中,POSH2-AS1高表达组的细胞生长速率低于对照组(P0.01),而低表达组的细胞生长速率高于对照组(P0.01)。4.在POSH2-AS1高表达和低表达A549及PC-9肺癌细胞系模型中进行平板克隆实验显示,POSH2-AS1高表达组细胞集落形成率低于对照组(P0.01),而低表达组细胞集落形成率高于对照组(P0.01)。5.在POSH2-AS1高表达和低表达A549肺癌细胞系模型中进行细胞周期检测显示,POSH2-AS1高表达组与其对照组相比,休眠期及分裂前期(G0-G1期)细胞数量增多(P0.01),DNA合成期(S期)细胞数量减少(P0.05),低表达组与其对照组相比,休眠期及分裂前期(G0-G1期)细胞数量减少(P0.01),DNA合成期(S期)细胞数量增多(P0.05);在PC-9肺癌细胞系中,POSH2-AS1高表达组与其对照组相比,休眠期及分裂前期(G0-G1期)细胞数量增多(P0.01),DNA合成后期及分裂期(G2-M期)细胞数量减少(P0.01),低表达组休眠期及分裂前期(G0-G1期)细胞数量减少(P0.01),DNA合成期(S期)细胞数量增多(P0.01),DNA合成后期及分裂期(G2-M期)细胞数量增多(P0.01)。在POSH2-AS1高表达和低表达A549肺癌细胞系模型中进行细胞凋亡检测显示,与其对照组相比,POSH2-AS1高表达组细胞凋亡率增加(P0.01),低表达组细胞凋亡率减少(P0.01)。6.在POSH2-AS1高表达和低表达A549及PC-9肺癌细胞系模型中进行细胞自噬水平检测,结果发现,POSH2-AS1对自噬的影响不显著。7.在POSH2-AS1高表达和低表达A549及PC-9肺癌细胞系模型中进行细胞迁移及侵袭实验显示,POSH2-AS1高表达组穿过小室的细胞数量低于对照组(P0.01),低表达组穿过小室的细胞数量高于对照组(P0.01)。8.裸鼠成瘤实验显示,与对照组相比,POSH2-AS1高表达组肺癌细胞在裸鼠体内生长能力降低(P0.01),低表达组肺癌细胞裸鼠体内生长能力增加(P0.01);裸鼠尾静脉注射肺转移实验显示,与对照组相比,POSH2-AS1高表达组细胞肺转移能力降低(P0.01),低表达组细胞肺转移能力增加(P0.01)。9.通过生物信息学分析显示,POSH2-AS1与POSH2存在天然碱基互补配对序列,POSH2-AS1与POSH2上游2214bp及POSH2第一个外显子578bp的碱基互补配对。通过分析POSH2-AS1和POSH2的基因表达情况发现,POSH2-AS1表达水平与POSH2表达水平呈正相关(肺癌组织r=0.374,P0.01;癌旁正常组织r=0.393,P0.01)。10.通过q-RT PCR检测与蛋白编码基因POSH2的表达水平,结果表明POSH2在肺癌组织中呈低表达(P0.05),其低表达与肺癌临床分期(I+II vs.III+IV,P0.01)、原发灶大小(T1+T2 vs.T3+T4,P0.01)、淋巴结转移(N0 vs.N1+N2+N3,P0.01)、远处转移(M0 vs.M1,P0.01)相关。11.对POSH2-AS1及POSH2在基因表达水平的研究发现,与对照组相比,高表达POSH2-AS1能够增加POSH2表达量(P0.01),而低表达POSH2-AS1能够降低POSH2表达量(P0.01)。12.通过对POSH2启动子荧光素酶报告基因载体分析POSH2-AS1对POSH2启动子活性影响,结果显示POSH2-AS1高表达能增加POSH2启动子活性(P0.05),低表达POSH2-AS1能够降低POSH2启动子活性(P0.01)。13.在POSH2-AS1高表达及低表达细胞模型中,进一步采用siRNA对POSH2-AS1的潜在靶基因POSH2进行敲低实验,观察其对细胞增殖及凋亡,结果显示,在敲低了POSH2表达后,POSH2-AS1高表达组的细胞生长速率高于对照组(P0.01),细胞凋亡率低于对照组(P0.01),而未敲低POSH2的高表达POSH2-AS1组细胞生长速率低于对照组(P0.01),细胞凋亡率高于对照组(P0.01)。对低表达POSH2-AS1进行敲低POSH2后,结果显示,既POSH2-AS1低表达又敲低POSH2组与不敲低POSH2只低表达POSH2-AS1组相比,细胞增殖、凋亡没有显著差异(P0.05),但其细胞增殖都高于对照组(P0.01),细胞凋亡率低于对照组(P0.01)14.通过对JNK通路核内转录反应元件质粒载体探究POSH2-AS1是否影响SPAK/JNK通路活化,结果显示,高表达POSH2-AS1可增加SPAK/JNK通路活性(P0.01),而低表达POSH2-AS1未明显降低SPAK/JNK通路活性(P0.05),但在饥饿处理细胞后,低表达POSH2-AS1表现出对SPAK/JNK通路活化的抵抗(P0.01)。结论:1.POSH2-AS1在肺癌组织中呈低表达,其低表达与肺癌临床进展相关。2.POSH2-AS1能够抑制肺癌细胞增殖、转移及侵袭,促进细胞凋亡,并在裸鼠体内可抑制肺癌细胞成瘤能力及肺转移能力。3.POSH2-AS1可正向调控靶基因POSH2及影响SPAK/JNK通路活化,从而参与肺癌细胞的生物学进程。本研究的创新之处:研究首次报道了反义长链非编码RNA POSH2-AS1在肺癌中的表达模式及与临床特征关系,通过一系列细胞功能实验探索其肿瘤生物学功能,并研究了其可能的调控机制。本研究的不足之处:需要进一步研究POSH2-AS1对其靶基因POSH2的直接调控机制及其参与肺癌发生发展的具体作用机制。此外,反义长链非编码RNA POSH2-AS1对可能的远端调控基因的研究暂未探索。研究总结:反义长链非编码RNA POSH2-AS1在肺癌组织中呈现低表达,其低表达与肺癌临床特征相关,并通过调控编码基因POSH2及影响SPAK/JNK通路发挥肿瘤细胞生物学功能。该研究提示反义长链非编码RNA POSH2-AS1可作为肺癌诊断的生物标志物及潜在的治疗靶点。
【图文】：

表达水平,样本,癌组织,肺癌组织

远处转移无 (M0) 84 (67.7) 55 (64.7) 0.209 0.648有 (M1) 40 (32.3) 30 (35.3)组织类型腺癌 53 (42.8) 37 (43.5) 0.150 0.928鳞癌 36 (29.0) 26 (30.6)其它 35 (28.2) 25 (25.9)经统计学检验，所研究的肺癌病例各临床特征在两中心分布无统计学差异。3.2 POSH2-AS1 在肺癌组织中的表达分布本研究通过 q-RT PCR 检测 POSH2-AS1 在两中心 209 对肺癌及癌旁正常肺组织中的表达情况。结果如图 3-1 所示，在华南肺癌病例人群中，POSH2-AS1 在癌组织中的表达水平低于癌旁正常组织的占 66.9% (83/124)，POSH2-AS1 在癌组织中的表达水平高于癌旁正常组织的占 33.1% (41/124)，与癌旁正常组织相比，POSH2-AS1 在肺癌中呈现低表达 (P=0.041)；在华东肺癌病例人群中，POSH2-AS1 在癌组织中的表达水平低于癌旁正常组织的占 61.2% (52/85)，POSH2-AS1 在癌组织中的表达水平高于癌旁正常组织的占 38.8% (33/85)，与癌旁正常组织相比，POSH2-AS1 在肺癌组织中呈现低表达 (P=0.045)。

表达水平,病例,临床分期,早期肺癌

图 3-2 POSH2-AS1 在总样本中的表达水平SH2-AS1 表达水平与肺癌病例临床特征及进展的关系究进一步分析 POSH2-AS1 的表达水平与肺癌病例临床特征的关系，发现在华南病例人群中，临床分期 1 期及 2 期早期肺癌病例，-AS1 病例占 44.0% (22/50)，低表达 POSH2-AS1 病例占 56% (28/5 3 期及 4 期的晚期肺癌病例中，高表达 POSH2-AS1 病例占 25.7%达病例占 74.3% (55/74)。经单因素及校正年龄、性别的分层分析-AS1 低表达与临床分期相关 (粗 P=0.035; 校正 P=0.036)。在原发及 T2 期病例高表达 POSH2-AS1 占 43.5% (30/69)，低表达 POSH.5% (39/69)；在T3期及T4期肺癌病例中，高表达POSH2-AS1病例，而低表达病例占 80.0% (44/55)。经单因素及校正年龄、性别的分POSH2-AS1 低表达与原发灶大小相关 (粗 P=0.007; 校正 P=0.007华东病例人群中，临床分期1期及2期早期肺癌病例中，高表达PO 55.2% (16/29)，低表达 POSH2-AS1 病例占 44.8% (13/29)；在临
【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R734.2

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