气管平滑肌震颤机理的研究及TMEM16A基因敲除小鼠模型构建

发布时间：2020-05-01 23:33

【摘要】：四乙基氯化铵(TEA)作为大电导激活的钾离子通道的阻断剂,它能够诱发小鼠气管环震颤,但是TEA诱导的小鼠平滑肌细胞震颤产生的分子机制以及调控平滑肌功能的作用上存在很大的争议。本论文以离体小鼠主气管环和单个气道平滑肌细胞为标本,借助生物机能实验系统(BL-420S)以及激光共聚焦显微器(LSM700),研究了钾离子通道阻断剂(TEA)、L-型电压依赖钙通道阻断剂(硝苯地平)、氯离子通道阻断剂(NA,尼弗酸)、胆碱能受体激动剂(ACh,乙酰胆碱)、三磷酸肌醇受体阻断剂(2-APB,2-氨基乙酯二苯基硼酸)、肌质网钙泵抑制剂(TG,毒胡萝卜素)、电压依赖性钠离子通道阻断剂(TTX,河豚毒素)、兰尼碱受体阻断剂(兰尼碱)、钠钙交换泵抑制剂(KB-R7943)在平滑肌周期性震颤中发挥的作用。结果显示TEA引发了气道震颤,震颤能够被硝苯地平、河豚毒素、尼弗酸、KB-R7943抑制,将细胞外液中的钠离子用锂离子替代,使钠钙交换体失活,震颤先增强后消失。这些结果表明L-型钙离子通道、电压依赖性钠离子通道、钙激活氯离子通道通道、钠钙交换体参与了震颤的发生。在单个小鼠气道平滑肌细胞的研究发现,TEA引发细胞内钙离子振荡,接着文章对细胞内钙库进行了研究,发现在毒胡萝卜素、2-氨基乙酯二苯基硼酸存在的情况下,TEA未能引发震颤,但是兰尼碱存在的情况下,TEA能够引发震颤,将细胞外钙离子移除,也能够抑制震颤,这表明三磷酸肌醇受体介导的钙离子的释放和钙库排空激活的通道介导的细胞外钙离子内流参与了离体小鼠气管环的震颤。所有数据表明,TEA引起的震颤是L-型钙通道、电压依赖性钠离子通道、钙离子激活的氯离子通道、钠钙交换体、三磷酸肌醇受体介导的钙离子释放和细胞外钙离子内流协同调控的结果。此外,文章第二部分进行了哮喘相关基因敲除小鼠模型的建立工作。以TMEM16A基因为编辑对象,根据CRISPR/Cas9系统设计原理,设计终筛选得到两条sgRNA。通过显微注射法,将sgRNA和Cas9mRNA注射到受精卵胞浆,最终得到五只F0代小鼠鼠尾基因组鉴定结果显示两只小鼠完成基因编辑。
【图文】：

气管环,小鼠,预收缩

第四章离体气管环震颤的引发4.1 前言TEA 作为钾离子通路的阻断剂，，能够阻断细胞膜上的钾离子通道，引起细胞膜轻微去极化。根据之前研究，TEA 能够刺激平滑肌细胞，诱发平滑肌震颤。本实验中，首先在小鼠离体气管环静息状态下，给予浓度梯度（1、10、20、30 mM）的 TEA 刺激，在浓度为 20 mM 时 TEA 诱发了明显的震颤(图 4.1A)。由于哮喘患者气管环处于收缩状态，利用低浓度的 ACh(1μM)对离体气管环进行预收缩处理，我们发现，TEA 同样诱发了离体气管环的震颤，(图 4.1B)。

气管环,阻断剂,小鼠,通道

图 5.1 VNa和 LVDCCs 在 TEA 诱导的小鼠气管环震颤中的作用 TEA 诱导的小鼠气管环震颤LVDCCs 阻断剂 nifedipine (A)和 VNa通道阻断剂 TTX (B)阻断。5.3 NCX 和 CaCCs 在 TEA 诱导气管环震颤中的作用细胞膜上 LVDCCs 通道的激活使钙离子从细胞外流入细胞内，导致了胞内钙离子升高，胞质内钙离子的升高引起钙离子激活的通道的激活。因为 T阻断了钙离子激活的钾离子通路，所以我们猜测，CaCCs 钙激活的氯离子通道与了 TEA 诱导气管环震颤。在实验中利用梯度浓度的 NA（尼弗酸）阻断 CaCC结果显示 31.6 μM 的 NA 阻断了 TEA 诱导气管环震颤(图 5.2，n=6)。同时细胞内钙的增加，也将会激活钠离子钾离子交换体 NCX，本实验中细胞外液的钠离子用锂离子替代，使 NCX 失活，TEA 诱发的震颤瞬时增强之消失 (图 5.3A，n=6)。而且，震颤也能够被 NCX 的选择性阻断剂 KB-R7943除 (图 5.3B，n=6)。这些结果显示，NCX 也参与了小鼠离体气管环的震颤。
【学位授予单位】：中南民族大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R562.25

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