PDIA3基因对结肠粘膜上皮细胞增殖和凋亡影响的实验研究

发布时间：2020-05-02 19:10

【摘要】：背景与目的:短肠综合征(short bowel syndrome,SBS)是指大部分小肠由于物理或功能性损失,致使小肠有效吸收面积过少进而出现的营养不良综合征。临床上以腹泻、水电解质紊乱、吸收障碍和进行性营养不良为主要特点。通常,当残余肠道长度≤35cm时可以定义为超短肠综合征(ultra short bowel syndrome,USBS)。当前,临床上对于SBS的治疗以非手术治疗为主,而其中主要依靠于肠外营养(Parenteral nutrition,PN)为SBS患者提供额外的营养补充,维持生理代谢需求。但PN同时也是一种高风险、昂贵和存在众多潜在不足的治疗方法。例如PN相关的导管性感染、肠粘膜萎缩、肝衰竭等,这些严重威胁了SBS患者的生命。尤其是对于USBS患者,由于剩余小肠极短或完全丧失小肠,终生需要依赖于PN并遭受上述风险的打击。所以,寻找一种安全、有效的方法促使此类患者残余结肠功能的代偿,使其减少对PN的使用或者摆脱对PN的依赖,是对USBS患者治疗的一种新思路。我们课题组前期研究通过构建USBS大鼠模型已经证实剩余结肠不论是在形态还是在功能上都可以发生代偿变化,并发现蛋白质二硫键异构酶A3(Protein disulfide isomerase A3,PDIA3)显著高表达于代偿的结肠组织中。PDIA3作为ER常驻氧化还原伴侣,研究已经证实其参与着众多关乎细胞生存的信号传导和调控环节,对细胞具有潜在促增殖的作用。那么,PDIA3在USBS结肠代偿中是否也作为关键调控蛋白而发挥着促结肠代偿的作用呢?我们既往的研究通过上调和下调结肠癌细胞(SW480)中PDIA3的表达,发现PDIA3对SW480细胞具有促进增殖和抑制凋亡的作用。那么,PDIA3在人正常结肠粘膜上皮细胞中是否也具有同样的作用呢?本实验通过构建过表达和沉默质粒,双向调控PDIA3在人正常结肠粘膜上皮细胞(NCM460)中的表达量,观察其对NCM460细胞是否同样能产生促进增殖并抑制凋亡的作用。为进一步研究PDIA3在结肠代偿中是否作为关键蛋白而发挥作用提供实验依据。方法:1.构建真核细胞过表达质粒(PDIA3-GV141)和沉默质粒(PDIA3-shRNA),使用DNA测序验证构建的成功与否;2.培养NCM460细胞系,使用脂质体瞬时转染技术将过表达质粒及沉默质粒分别转染NCM460细胞;3.Western blotting方法分别检测转染不同剂量过表达和沉默质粒后细胞PDIA3蛋白表达量的变化情况;4.CCK-8法分别检测转染不同剂量过表达和沉默质粒后24h、48h、72h的细胞增殖率;5.流式细胞技术分别检测转染不同剂量过表达和沉默质粒后细胞的凋亡率。结果:1.DNA测序验证成功合成真核细胞过表达质粒(PDIA3-GV141)和沉默质粒(PDIA3-shRNA)。2.Western blotting条带提示:过表达实验中,实验组NCM460细胞PDIA3的表达量高于空载体组,且与转染质粒的剂量呈正相关;沉默实验中,实验组NCM460细胞PDIA3的表达量低于空载体组,且与转染质粒的剂量呈负相关。3.CCK-8示:过表达实验中,实验组在24h、48h、72h增殖率均低于空载体组(P0.05,差异有统计学意义);沉默实验中,实验组在24h、48h、72h增殖率均高于空载体组(P0.05,差异有统计学意义)。4.流式结果示:过表达实验中,实验组细胞凋亡率均高于空载体组(P0.05,差异有统计学意义);沉默实验中,实验组细胞凋亡率均低于空载体组(P0.05,差异有统计学意义)。结论:PDIA3抑制人结肠粘膜上皮细胞(NCM460)的增殖,促进其凋亡。
【图文】：

光镜,电镜,结肠,小肠

图 1-2 USBS 及正常大鼠结肠粘膜在光镜和电镜下的改变[34][36]Fig 1-2 Change in colonic mucosal under optical and electron microscope of USBSand normal rats[34][36]功能上：主要表现为对水分、氨基酸及木糖醇等营养素的吸收增加[33][37]。而在临床上，直接证据则是：USBS 患者经过长时间代偿后，逐步减少 PN 的使用或者摆脱对 PN 的依赖性。不仅如此，由于结肠存在“结肠消化”作用[38]，例如纤维素无法在小肠被吸收，但进入结肠内能被菌群酵解并生成 SCFA，可为机体带来 4.2 mJ / d 额外的能量吸收[28]，是广泛肠切除后患者能量来源的重要保障。为此，ESPEN 相关指南[39]甚至认为保留大部分结肠，在能量的吸收上相当于保留了至少 50cm 的小肠。而功能上的另一代偿作用则表现在肠内容物运输减慢，延长营养物在肠腔内的停留时间进而使其吸收增加[40-41]。SCFA 不仅能直接为结肠粘膜细胞提供代谢底物，促进其生长和代偿，相关研究还发现其可能参与神经

分子结构图,分子结构

图 1-3 PDIA3 的分子结构Fig 1-3 The molecular structure of PDIA3.3.2. PDIA3 的生物学功能ER 中：PDIA3 在 ER 中通常被视为常驻氧化还原伴侣。其通过与钙网蛋白钙联蛋白（CRT 和 CNX）的 P 结构域结合，，介导蛋白质的折叠作用[73]。CRT /NX 通过特异性结合错误折叠的蛋白质并阻止它们从 ER 分泌而协助蛋白质合的质量控制；最近研究表明，PDIA3 在蛋白质折叠中的生理功能作用可以被劫，以促进病毒在某些条件下的感染：PDAI3 异构化 SV40 病毒衣壳蛋白（病毒初始脱壳组成部分）的二硫键[74]。细胞膜上：PDIA3 的巯基-二硫键交换能力还通过建立分子间和分子内的二键在膜位点发挥着重要的作用。PDIA3 在配子成熟过程中上调，是精子和卵子
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R574

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