核桃举肢蛾神经肽基因鉴定和分析

发布时间：2020-05-03 21:06

【摘要】：核桃举肢蛾(Atrijuglans hetaohei Yang)属鳞翅目、织蛾科、黑展足蛾属,是严重危害核桃果实的一种主要的蛀果类害虫。国内外学者对核桃举肢蛾的研究大多集中在生活史,田间危害、防控技术及触角局部特征等方向。为了解核桃举肢蛾成虫存在的神经肽种类及分布情况,本试验利用课题组获得的核桃举肢蛾转录组数据筛选出8条候选内参基因,应用荧光定量PCR技术筛选了举肢蛾不同发育时期、性别和在幼虫不同组织样品中最适内参基因及数目;利用举肢蛾头部转录组数据,鉴定出32个神经肽基因,40个神经肽受体基因,并通过荧光定量分析了部分神经肽基因及神经肽受体在不同性别、不同组织中的表达情况,主要研究结果如下:1核桃举肢蛾内参基因筛选及最适内参基因数目的确定从核桃举肢蛾转录组数据中鉴定分析得到8条常用于筛选内参参照的基因,分别为GAPDH、β-Tubulin、TBP、Histone、UBC、AK、28S和ELF,利用荧光定量PCR检测了各基因在虫体不同发育阶段、不同性别中的表达,利用GeNorm、NormFinder、BestKeeper和在线软件RefFiner分析各基因的表达稳定性:在核桃举肢蛾不同发育时期和性别中,各候选内参基因的稳定性由高到低分别为GAPDH28ShistoneTBPELFUBC9AKβ-Tubulin,若采用多内参进行数据的校正,则需要选择GAPDH和28S两个基因;不同组织部位中,各内参基因稳定性为28ShistoneTBPGAPDHAKELFUBC9β-Tubulin,若采用多内参进行数据的校正,则需要28S、histone和TBP三个基因。2核桃举肢蛾成虫头部神经肽及受体基因的鉴定利用举肢蛾头部转录组数据查找神经肽及受体基因,而后经tBlastx进行同源序列比对,筛选得到32个神经肽基因,其中包含神经肽AKH1、AT、DH31、DH45、FMRF、ITG、Ork、PBAN、Pro、SIF、sNPF、TK等12条具有完整的开放阅读框;AKH2、AstB、CAPA、CCH2、PTTH、Bur、CRF、ETH、LK、NPFb等10条序列具有5'非编码区;CCH1、MS、NP和NPLP1具有3'非编码区。40个神经肽受体基因中,A1、A4、A10、A12、A13、A15、A20、A23、A26等9条序列具有完整的开放阅读框,NPYR和SPR1具有5'非编码区;Ast R、DHR、NPR、MCHR、INR、A7、A8、A11、A17、A27、A29、A30、A31、A32、Thyrotropin-releasing hormone Receptor等15条序列具有3'非编码区。3神经肽及受体基因在核桃举肢蛾不同组织中的表达通过RT-qPCR方法定量分析举肢蛾22条神经肽及22条受体基因在核桃举肢蛾不同性别及组织中的表达,AKH1、AstB、CCH1、CCH2、CCAP、ITG、ETH、MS、OKA、PTTH等基因在雄成虫头部表达量最高,明显高于胸部和腹部;NP、FMRF、PTTH等基因在雄成虫腹部表达量高;Bur、CAPA、DH31、NPLP1、PBAN、SIF等基因在雌成虫表达量高,其中Bur在雌成虫腹部表达量高,NPLP1、PBAN和SIF在雌成虫头部表达量均明显高于雄成虫;神经肽受体A6-A、A8、A9、A11、A12等9个受体基因在雄成虫头部的表达量明显高于雌成虫,A1、A4、A10、A13在成虫腹部中表达量高于头部和胸部,且在雄蛾中的表达量高于雌蛾;A20在头部和腹部中的表达量明显高于胸部;A24在雌蛾头部中表达量最高;DHR在雌蛾胸部表达量最高。本研究确定了不同发育阶段、不同组织RT-qPCR的最适内参基因和最适内参基因数目,鉴定和分析了存在于核桃举肢蛾成虫头部的多条神经肽和受体基因,并定量分析了神经肽和受体基因在核桃举肢蛾成虫不同组织的表达情况,为进一步深入研究核桃举肢蛾发育、生理信号调控奠定了基础。
【图文】：

-TUB、ELF、GAPDH、Histone、TBP、28S、UBC9 的斜率及扩增效率，如表 2-2 所 个内参基因的斜率均在-3 - -3.5 之间，线性相关系数（R2）均大于 0.9800，扩增效率2％-115％。表 2-2 8 个内参候选基因的相关参数Table2-2 The parameters derived from RT- qPCR analysis of 8 candidate reference genes基因名称Gene name扩增效率Efficieny（%）斜率slope相关系数Correlation RAK 114% -3.0274 0.9942β-TUB 92.8% -3.5063 0.9891ELF 103.4% -3.2422 0.9917GAPDH 96.9% -3.3983 0.9816Histone 95.1% -3.4448 0.982TBP 112.4% -3.0562 0.990328S 113.1% -3.0429 0.996UBC9 112.8% -3.0495 0.995

基因表达稳定性分析举肢蛾的每个样品均进行了 3 次技术学重复和 3 次生物学重复，后原始 Ct 均值进行分析。在所有样本中，，每个基因的平均 Ct 值的分同性别和发育时期条件下 8 个内参基因的 Ct 值的分布在 18.94（TBAK 的 Ct 值）之间；不同发育时期中 8 个内参基因的 Ct 值分布在 到 29.74（histone 的 Ct 值）之间。Norm 程序对内参基因稳定性计算orm 程序的功能之一是利用各基因下在各样本所表达的 Ct 值，进行命令得出稳定均值 M，且 M 值与基因的稳定性形成负向规律。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S436.64

【参考文献】

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1 郝兴宇;张金桐;王瑞;曹天文;;核桃举肢蛾性信息素通讯系统扫描电镜观察[J];山西农业大学学报(自然科学版);2005年04期

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1 徐军;甜菜夜蛾滞育激素—性信息素合成激活肽基因（DH-PBAN）和促前胸腺激素（PTTH）基因的克隆和表达分析[D];中国科学技术大学;2007年

本文编号：2648124