OsbZIP81水稻转基因植株的构建和限制性内切酶I-SceI的制备

发布时间：2020-05-04 18:53

【摘要】：本论文主要分成两个部分:1.水稻OsbZIP81转基因材料的构建及其与OsIMPa4相互作用的初步探究;2.限制性内切酶I-SceI的制备。农杆菌介导的水稻遗传转化,能将包含外源基因的T-DNA整合到水稻基因组中,并能稳定遗传。研究表明拟南芥基因AtIMPa4在T-DNA复合物入核,AtVIP1在T-DNA整合到基因组的过程中都发挥重要的作用,同时AtVIP1作为拟南芥bZIP转录因子能调控下游基因响应非生物胁迫。本研究对AtVIP1在水稻中的同源基因OsbZIP81展开了初步研究,结果如下:1.OsbZIP81属于水稻bZIP转录因子第IX亚家族的基因,有三个转录本。通过同源比对AtVIP1与水稻bZIP第IX亚家族的基因,发现它们的bZIP结构域都很保守,同时OsbZIP81与AtVIP1具有很高的氨基酸序列相似度。2.构建了OsbZIP81的超表达与CRISPR敲除的转基因水稻植株,发现在超表达转基因植株中OsbZIP81表达量明显高于野生型,在CRISPR敲除转基因植株中OsbZIP81的表达量则显著降低。3.OsIMPa4是AtIMPa4在水稻内的同源基因,酵母双杂交以及BiFC结果显示OsIMPa4与OsbZIP81的三个转录本蛋白都能相互作用。限制性内切酶是分子生物学中一种非常重要的工具酶。I-SceI是酿酒酵母线粒体内含子编码的一种限制性内切酶,它的识别位点为18个碱基的非回文序列,酶切后产生不对称的粘性末端,并且在动植物基因组中不含或只含有极少的酶切位点。因此I-Sce I适用于BAC文库中大片段外源DNA的酶切检测和不同载体之间大片段外源DNA的交换。本研究通过基因合成、克隆、表达、纯化获得重组蛋白GST-I-SceI,测得蛋白浓度是590 mg/L,通过酶切质粒验证得到GST-I-SceI蛋白酶活是0.2 U/μL,GST-I-SceI比活约为340 U/mg。
【图文】：

6图 1 OsbZIPs 的进化分析及 OsbZIP 蛋白结构域的比对（Z. G. E et al 2014）A: OsbZIPs 的进化分析 B: OsbZIP 蛋白结构域的比对Fig. 1 phylogenetic analysis of OsbZIPs and domain alignment in OsbZIP proteins.（Z. G. E et al 2014）Panel A : phylogenetic analysis of OsbZIPs Panel B:domain alignment in OsbZIP proteins.

图 3 OsbZIP81 基因三个转录本之间的关系Fig. 3 The relationship between three transcripts of OsbZIP81 gene从上图中可以看出，OsbZIP81.1 与 OsbZIP81.3 的后半部分完全相同，但是bZIP81.1 与 OsbZIP81.2 在 3’端有 81bp 是不相同的。本研究重点是围绕 OsbZIP OsbZIP81.2 这两个转录本展开研究的。5.2 超表达载体的鉴定本研究将 OsbZIP81 的前两个转录本 OsbZIP81.1、OsbZIP81.2，，通过酶切酶超表达载体 pU1301-OsbZIP81.1-Flag、pU1301- OsbZIP81.2-Flag。图 4 为用 Ba KpnI 分别双酶切两个重组超表达载体的电泳胶图。酶切后的片段大小符合预
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943.2

【参考文献】

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1 孙晓丽;李勇;才华;柏锡;纪巍;季佐军;朱延明;;拟南芥bZIP1转录因子通过与ABRE元件结合调节ABA信号传导[J];作物学报;2011年04期

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3 曹明霞,卫志明,黄健秋;根癌农杆菌介导的水稻遗传转化[J];植物生理学通讯;2002年05期

4 李卫,郭光沁,郑国

本文编号：2648843