针刺对心肌缺血基因谱的调控特征的跨种属生物信息分析

发布时间：2020-05-05 01:27

【摘要】：背景:近年来中医药对缺血性心肌病的研究1经进入分子和基因水平,大量的实验证明,针刺对改善心肌缺血的效果良好,且随着基因芯片以及二代测序、生物信息分析等技术的应用,基础动物实验和临床试验的研究成果取得了很大进展。然而限于各种客观因素影响,临床试验与基础动物实验研究之间有较大区别,特别是物种间差异导致动物模型的结果难以应用到临床。据我们了解,目前为止还没有对动物实验和临床试验进行有效的比对分析的研究,更没有人提出将二者结合进行数据处理的方案。这对于临床和实验的互相促进是巨大的障碍!目的:比较人和大鼠间针刺对心肌缺血疾病的基因谱调控信息的异同点,通过生物信息学技术分析针刺对心肌缺血性疾病治疗机制的关键基因以及通路,以期在利用动物模型进行人类疾病研究时,能为临床试验研究方案的确定和动物模型的开发提供可行的指导。方法:数据来源于基于本课题组针刺内关穴治疗心肌缺血疾病的临床试验(外周血中性粒细胞)和动物实验(缺血边缘心肌组织)高通量测序后的原始数据,通过生物信息学方法分析处理,筛选出针刺前后基因表达差异倍数较高的基因群(判断标准log2(fold-change,FC)|±1|,≥1为上调,≤-1为下调),然后寻找出共同调控的基因,比较二者异同,使用DAVID对进行基因功能注释,并在此基础上进行KEGG_PATHWAY通路分析,使用String分析和预测蛋白质-蛋白质相互作用网络,过滤和评估功能性基因组学的数据,提供跨物种预测。结果:针刺后不同种属实验对象共同上调的差异表达关键基因178个,共同下调20个。Pathway分析上调的信号通路,发现主要差异基因都集中在线粒体、氧化还原、氧化磷酸化、三羧酸循环、稳态过程、核糖体、炎症和免疫因子等方面。这个现象说明了针刺增强了心肌细胞缺血后的线粒体功能,开放了能量和氧化还原反应,提高了稳态过程,从而纠正了由于心肌缺血破坏的线粒体稳态平衡、ATP合成减少、ROS生成增加、线粒体片段化、膜通透性变化。此外还有心肌收缩、肥厚型心肌病(HCM)、扩张型心肌病相关基因,在缺血的心肌组织中显著降低,而电针治疗后明显增加。虽然下调的这20个基因并没有形成特定的通路,但是其中包含的MAP3K2、MMP9等基因都有报道与心肌缺血密切相关。结论:线粒体能量代谢、氧化还原反应、心肌细胞稳态平衡,炎症反应,心肌收缩等相关通路的基因在针刺内关穴治疗心肌缺血疾病的临床试验和动物实验中具有可靠的一致性改变,TNNT2、ACTC1、ATP2A2、TNNC1、MYH6、TPM1等基因在针刺内关穴改善心肌缺血的机制中起到重要作用,在以后的实验室研究和临床研究中可以作为重要参考。但是临床试验中表现很突出的CXCR2、IL1R2等免疫相关基因并未在动物实验中发现有统计学意义的变化,而与其相关的XCL1、CCR10、CXCL、CCR10等相关的基因发生了明显改变,说明临床心肌缺血疾病的形成伴随着长期的炎症过程,而动物疾病通过手术结扎快速造模,病理特征更多的表现在心肌细胞的快速应激,能量的氧化代谢方面,所以我们建议以后的动物实验应该做出调整,选择更加贴近临床病理形成的特征来造模。
【图文】：

文件位置

注：－ｏ指定输出文件路径，－ｆ强制指定输入文件格式，如：ｆａｓｔｑ，ｂａｍ，ｓａｍ逡逑（默认会自动检测文件格式），此外，使用－ｔ邋（ｔｈｒｅａｄｓ）使用多线程处理，每逡逑个线程大约占２５０ＭＢ内存（不能在３２位系统上运行超过６线程），加上－ｑ参逡逑数则进入安静模式，不提示任务完成进度。生成的质量报告结果（图一所示）逡逑为一个ＨＴＭＬ的网页的ｚｉｐ压缩包文件，包括测序数据的基本信息、每个碱逡逑基的质量值、每条ｒｅａｄｓ序列的质量值、每条序列的ＡＴＣＧ组成、每条）予列Ｎ逡逑的含量、每条序列的长度分布、序列中ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ程度、Ｋ－ｍｅｒ信息等。部分逡逑结果如图１－４所示。逡逑９逡逑

碱基,软件,免疫共沉淀,序列比对

２．数据处理方法与关键过程逡逑２．１邋ＣｈＩＰ－ｓｅｑ数据分析逡逑染色质免疫共沉淀后测序（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ邋Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ邋ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＣｈＩＰ－ｓｅｑ）逡逑包括染色质免疫共沉淀（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ－ｉｍｍｕｎｏｐｒｅ－ｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，ＣｈＩＰ）实验和高通量测逡逑序（Ｈｉｇｈ－Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ邋Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）两个部分。数据基本处理包括：①数据预处理、逡逑②ｒｅａｄｓ序列比对定位、③富集区（峰）识别，及④后续处理。分析流程如图２．１逡逑所示。逡逑其中序列比对是ＣｈＩＰ－ｓｅｑ分析流程中使用计算资源最大一步，是数据分析逡逑的最重要过程，涉及几种不同思路的算法（１）空位种子片段索引法：包括ＥＬＡＮＤ、逡逑ＭＡＱ［５２］等软件，（２）邋ＢＷ邋（Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ）转换算法：ＢＷＡ［５３］、Ｂｏｗｔｉｅ［５４］、逡逑ＳＯＡＰ２［５５］等，各软件各有优劣。搜峰〔ｐｅａｋｃａｌｌｉｎｇ〕，即基因富集区域（ｐｅａｋ，峰）逡逑的识别，常用搜峰软件如ＭＡＣＳ［５６］，，邋Ｐｅａｋｓｅｑ［５７］，ＺＩＮＢＡ＿等。适用于分析ｓｈａｒｐ逡逑ｐｅａｋ的代表性软件主要有ＭＡＣＳ，分析ｂｒｏａｄ邋ｐｅａｋ的代表性搜峰软件有ＳＩＣＥＲ逡逑
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R245

【参考文献】