胆道闭锁相关基因筛选及TLR7信号通路在其发病中作用的研究

发布时间：2020-05-07 00:53

【摘要】：目的:应用RRV感染Balb/c新生小鼠建立胆道闭锁动物模型,观察小鼠的一般状况并检测小鼠血清和肝脏中趋化因子的表达情况,探讨疾病的病因和早期评估指标。根据小鼠一般状况及血清学检测的结果选取标本,借助基因芯片技术,对胆道闭锁小鼠肝脏标本全基因表达谱水平和microRNA表达水平的差异进行筛选,并进行生物信息学分析和RT-PCR验证。根据基因芯片筛选出的差异基因和生物信息学分析的结果选取目标基因,为进一步揭示胆道闭锁的发病机制,进行一系列的验证实验。方法:1、恒河猴轮状病毒Balb/c小鼠胆道闭锁模型的构建及标本收集;选取健康的新生Balb/c小鼠进行动物实验,将生后24小时内腹腔注射轮状病毒者定为胆道闭锁实验组(n=68),腹腔注射等量病毒培养液者设定为正常对照组(n=72),每日观察小鼠的病情变化并记录体重和生存情况,分别于注射病毒后第1、3、5、7、10、14天处死小鼠并获取血清标本、肝外胆管标本和肝脏标本。2、血清总胆红素和直接胆红素的测定;利用相关血清胆红素试剂盒和酶标仪技术,分别检测两组小鼠在不同时间点时血清中总胆红素和直接胆红素的水平。3、肝脏和肝外胆管组织形态学结构改变的观察;对小鼠的肝脏和肝外胆管标本进行HE染色,观察小鼠肝脏标本在不同时间段内肝脏组织和肝外胆管组织结构的改变。4、血清和肝脏中趋化因子的检测;利用趋化因子试剂盒和流式多因子测定技术,分别检测各组在不同时间段时血清和肝脏中12个趋化因子的表达情况,并进行统计学分析。5、基因芯片筛选肝脏中差异表达基因和生物信息学分析;选取腹腔注射后第7天处死的小鼠并获取肝脏标本,胆道闭锁实验组和正常对照组各3例标本。处理后的标本与Affy GeneChip Mouse Gene 1.0 ST Array小鼠全基因组基因表达芯片杂交,扫描仪上扫描芯片。应用GCBI平台进行数据分析,分析胆道闭锁实验组和正常对照组小鼠肝脏组织基因表达谱间的差异,并对所得差异基因进行表达差异的显著性分析、功能分析、信号传导通路显著性分析并构建基因通路相互作用网络。6、基因芯片筛选肝脏中差异表达的microRNA和生物信息学分析;处理后的标本与Affy GeneChip miRNA 4.0 Array芯片进行杂交,扫描仪上扫描芯片。应用GCBI平台进行数据分析,分析胆道闭锁实验组和正常对照组小鼠肝脏组织microRNA间的表达差异,并用RT-PCR的方法对microRNA的结果进行验证。7、对TLR7信号通路在胆道闭锁发病过程中的功能进行验证;分别对两组小鼠第1、3、5、7、10、14天6个不同时间点的肝脏标本进行石蜡包埋,连续切片后进行TLR7免疫组织化学染色;肝脏标本经过蛋白质提取后对TLR7信号转导通路中的关键调节蛋白TLR7和P-IRF7进行Western blot检测;肝脏标本经过RNA提取后用Real-time PCR来验证关键基因TLR7在各组中的表达情况。用流式多因子技术检测通路下游效应细胞因子IFNβ、IL-6和IL-1α的表达情况。体外培养人肝内胆管上皮细胞,并用慢病毒转染技术对细胞的TLR7基因表达进行干扰,然后用RRV感染细胞,观察细胞病毒病变的情况。8、对数据进行统计学分析;采用SPSS19.0统计软件对所得数据进行统计分析,定性资料采用独立样本R×C列联表资料的χ2检验;定量资料,以均数±标准差(s±x)表示,采用配对设计资料的t检验或独立样本资料的t检验。按α=0.05的检验水准,以p0.05为差异有统计学意义。结果:1、胆道闭锁动物模型的构建及临床表型观察;成功构建胆道闭锁动物模型,复制了疾病的生长迟缓、皮肤黄染及白便等临床症状。2、血清总胆红素和直接胆红素的测定;血清胆红素的检测结果发现,胆道闭锁小鼠的血清总胆红素于第5天开始上调并逐渐升高,血清直接胆红素于第7天开始上调并逐渐升高。3、肝脏和胆管组织形态学结构改变的观察;肝外胆管HE染色结果显示,第7天时胆道闭锁组小鼠肝外胆管出现闭锁和局限性扩张;第14天时胆道闭锁组小鼠肝外胆管纤维化明显并且胆管上皮细胞出现性状的改变;而第7天时正常对照组小鼠肝外胆管直径均匀一致,胆管上皮细胞排列整齐呈线状。肝脏标本HE染色结果显示,第3天时胆道闭锁实验组和正常对照组肝脏内组织结构无明显差异;第5天时胆道闭锁小鼠组肝脏内出现炎症浸润;第10、14天胆道闭锁实验组肝内胆管结构开始消失。4、肝脏和血清中12个趋化因子的表达情况;趋化因子检测结果发现,其中,CCL22、CXCL5和CXCL13在肝脏和血清中的表达,组间无明显差异和变化趋势;其他9个指标中,与正常对照组相比,胆道闭锁实验组小鼠除CCL2、CCL20和CXCL9血清中表达上调明显外,其他趋化因子均在肝脏中表达上调明显。其中CCL2、CCL4、CXCL1和CXCL11于第3天开始表达上调,早于血清总胆红素;CCL3、CCL4、CCL5、CCL20、CXCL1、CXCL10和CXCL19从第7天起也各自出现表达上调。5、基因芯片筛选肝脏中差异表达基因和生物信息学分析;以p值0.05、q值0.05差异倍数在2倍以上为标准,发现胆道闭锁实验组与正常对照组小鼠肝脏相比存在254条差异表达的基因。进一步对差异基因进行生物信息学分析,其中差异表达基因的显著功能分析的结果发现:这些差异基因的功能主要涉及先天性免疫应答、应对病毒反应、防御病毒反应、氧化还原过程、代谢过程、干扰素β的细胞应答、病毒基因组复制的负调控和免疫反应等,其中差异最明显的是先天性免疫应答。进一步进行差异基因通路网络分析,发现TLR受体信号通路和凋亡信号通路的差异基因表达具有一致性上调的特点,并且在网络中具有相关性。因此,对功能分析中先天性免疫应答部分的差异基因按p值进行排序,发现TLR7上调最显著,并且其下游基因IRF7也有一定程度的上调。6、基因芯片筛选肝脏中差异表达的microRNA和生物信息学分析;胆道闭锁实验组与正常对照组小鼠肝脏相比存在11条差异的microRNA。其中,miR-29a-3p的功能联系最广泛。RT-PCR验证结果发现miR-29a-3p、miR-293-3p、miR292-3p和miR-29b-1-5p这4个microRNA的表达有明显表达上调,并且差异有统计学意义。剩余的7个microRNA中,miR-205-5p、miR-292-5p、miR-6240、miR-290a-5p和miR-8109这5个microRNA的表达胆道闭锁实验组高于正常对照组;miR-708-5p和miR-1839-3p这2个micro RNA的表达胆道闭锁组低于正常对照组。接着对RT-PCR的验证结果进行差异倍数分析,并与芯片结果中的差异倍数进行比较,发现RT-PCR验证结果中各个microRNA的表达差异倍数的趋势与基因芯片趋势一致,但是差异倍数的数值均低于芯片中的结果。7、对TLR7信号通路在胆道闭锁发病过程中的功能进行验证;免疫组化结果显示第3、5天时胆道闭锁实验组和对照组间肝脏内结构和TLR7表达无明显差异;第7天时胆道闭锁组胆管上皮TLR7开始表达,并且肝内胆管周围出现炎性细胞浸润;第10、14天时肝内胆管组织逐渐消失,血管内皮细胞受损,血管周围胆管处可见明显的TLR7阳性的炎性细胞浸润。Western blot对TLR7蛋白表达进行半定量分析,PCR对TLR7基因的转录水平进行定量分析,结果一致性表现为TLR7于第5天出现上调,并逐渐上升,第10、14天时达到最高。Western blot对其下游基因IRF7的激活状态P-IRF7蛋白进行半定量分析,结果发现第5天开始胆道闭锁实验组小鼠肝脏内的P-IRF7蛋白明显激活,正常对照组虽然TLR7表达有一定的上调,但是其下游基因P-IRF7蛋白基本无激活表现。流式多因子技术检测肝脏内细胞因子IFNβ、IL-6和IL-1α的表达情况,发现这三个TLR7信号通路的效应因子从第5天开始均有不同程度的表达上调。TLR7沉默后,人肝内胆管上皮细胞感染RRV后的病毒病变出现更早并且病变更严重。结论:接触病毒后第7天是胆道闭锁小鼠发生胆道闭锁改变的关键时期。大量炎症趋化因子参与胆道闭锁小鼠发病过程,其中CCL2、CCL4、CCL11和CXCL1上调较早,参与疾病的发生;CCL3、CCL5、CCL20、CXCL9和CXCL10上调较晚,参与疾病的发展;由此推测可以通过多指标血清学检测,早期对疾病进行评估。胆道闭锁小鼠的发病与免疫反应有密切的关系;其中先天性免疫反应和机体应对病毒的反应发挥着重要的作用。其中TLR7信号通路可能在胆道闭锁小鼠的发病过程中起到了一定的保护作用。
【图文】：

细胞肿胀,细胞间隙,变圆,增宽

成致密单层；接种病毒约2~3天后，细胞开始发生细胞病变效应（cytopahogeniceffect，CPE）表现为细胞间隙增宽，细胞肿胀、变圆、悬浮、胞质混乱、核碎裂，3~5天时50%～60%的细胞发生CPE (见图1.1 )。

胆道闭锁,所指,小鼠,箭头

中国医科大学博士学位论文9图1.2. （A）为第7天小鼠，左边四只红色箭头所指为胆道闭锁实验组，右边两只蓝色箭头所指为正常对照组。与右侧两只正常对照组相比，左侧胆道闭锁实验组可见皮肤黄染和生长迟缓，并且从左到右依次有不同程度加重。（B）为第14天小鼠，左边蓝色箭头所指为正常对照组小鼠，右边红色箭头所指为胆道闭锁实验组小鼠。与左边正常对照组小鼠相比，右边胆道闭锁实验组小鼠，，皮肤裸露区：眼睑、前爪和鼻翼处可见明显皮肤黄染，并且毛发油腻。（C）为第7天小鼠的腹腔解剖图，左边红色箭头所指为胆道闭锁实验组小鼠，右边蓝色箭头所指为同龄的正常对照组小鼠。可见与右边正常对照组相比
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R722.1

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