二硫吡咯酮类化合物Thiolutin和Aureothricin生物合成基因簇的研究

发布时间：2020-05-07 00:54

【摘要】：二硫吡咯酮类化合物具有独特的二硫吡咯酮环结构。还原型的二硫吡咯酮类化合物能够螯合细胞内Zn~(2+)依赖酶的金属离子,从而影响细胞内泛素化进程以及RNA的转录,对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌以及肿瘤细胞都表现出较强的抑制活性。目前,关于二硫吡咯酮类化合物生物合成的研究报道还比较少,仅有holomycin的生物合成途径被部分解析。与holomycin类二硫吡咯酮化合物不同,thiolutin类化合物在二硫吡咯酮环的N_4位上多了一个甲基,导致其抑制真菌和肿瘤细胞的活性更强。因此,研究thiolutin类二硫吡咯酮化合物的生物合成基因簇,解析此类化合物的生物合成机制具有重要的研究意义。前期研究从产thiolutin和aureothricin的链霉菌Streptomyces thioluteus DMS40027中发现一个二硫吡咯酮类化合物的生物合成基因簇aut,可在白色链霉菌中异源表达产生N_4位上缺少甲基化修饰的二硫吡咯酮类化合物holomycin和N-propionylholothine。为了探究aut基因簇中各基因的功能,本研究对可能的结构基因、氧化还原酶基因、转录调节基因分别进行了基因敲除实验。发现硫酯酶基因autC、非核糖体多肽合成酶基因autE、脱羧酶基因autF以及硫氧还原蛋白氧化还原酶基因autI敲除后,异源表达产物holomycin和N-propionylholothine无法合成,证明这4个基因为aut基因簇生物合成必须的结构基因。在前期已鉴定的两个二硫吡咯酮类化合物的生物合成基因簇thi和hlm中也发现了这4种结构基因的存在,但三个基因簇的异源表达产物所包含的侧链基团却不尽相同。为了探究位于不同基因簇的同源基因在功能上是否存在差异,我们在进行基因回补实验的同时,也尝试使用来自其它基因簇的同源基因互补缺失基因的功能。发现硫酯酶基因hlmC和thiC可以代替autC发挥功能,将NRPS催化生成的中间产物从T domain上水解下来。脱羧酶基因hlmF和thiF可以代替autF发挥作用,将两个半胱氨酸缩合物的羧基水解下来。这些同源基因的功能相同。酰基转移酶能够将不同种类的酰基转移到二硫吡咯酮环的N_7位,从而产生多种二硫吡咯酮类化合物。酰基转移酶基因autA敲除后,异源表达产物holomycin产量降低,而N-propionylholothine消失。除了autA基因能够回补自身的缺失,从而恢复两种异源表达产物的合成以外,同源基因thiA1和thiA2无法互补autA的功能,而hlmA的互补只是恢复了holomycin的产量,而无法产生N-propionylholothine。这些结果表明4个酰基转移酶的底物特异性存在着差异。生物信息学分析发现AutA比HlmA多出了一个PLP依赖的裂解酶结构域,暗示着AutA可能具有额外的功能。NRPS是二硫吡咯酮类化合物生物合成中最为关键的核心酶,催化两个半胱氨酸底物缩合形成二硫吡咯酮环的骨架。NRPS基因thiE可以替代autE,恢复autE基因缺失突变菌株中二硫吡咯酮类化合物的合成,而来自hlm基因簇的同源基因hlmE则不能。暗示着HlmE与ThiE和AutE在功能上存在差异。thi和aut基因簇是从产生thiolutin类型的菌株中鉴定得到的,而hlm则是来自于产生holomycin的菌株。NRPS基因功能的差异暗示着thiolutin类和holomycin类二硫吡咯酮环的合成途径可能并不完全相同。此外还发现敲除氧化还原酶基因orf8和orf9,不仅没有妨碍holomycin和N-propionylholothine的合成,反而促使其产量明显提高。而编码转录调节因子的基因orf1、orf3、orf4和orf5的敲除没有影响holomycin和N-propionylholothine的产生,说明它们未参与到异源表达产物的合成途径中。
【图文】：

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[4]。此外，近几年来还发现二硫吡咯酮类化合物具有抗肿瘤的活性。二硫吡咯酮类化合物因为具有独特的二硫吡咯酮环结构（图1.2.1），所以在389nm波长下表现出强烈的紫外吸收。依据侧链基团的不同，这类化合物可分为三类：N4-甲基化-N7-酰基化吡咯烷（thiolutin类型），N7-酰基化吡咯烷（holomycin类型）和一类特殊的有机酸加载在DTP结构上的thiomarinol。图1.2.1 二硫吡咯酮类化合物的化学结构Fig. 1.2.1 Structures of isolated dithiolopyrrolones早期的研究普遍认为二硫吡咯酮类化合物的作用靶点是细菌的RNA聚合酶，而最近的一些研究证实这类化合物在真核细胞中的靶点并不是II型RNA聚合酶，而是泛素-蛋白酶体系统。还原性thiolutin能够抑制包含JAMM结构域的金属蛋白酶Rpn11，

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氨酸脱水缩合形成吡咯酮环，再在侧链上添加活化的有机酸从而形成二硫吡咯酮类化合物。图1.4.1 假定的二硫吡咯酮类化合物的生物合成途径[17]Fig.1.4.1 Proposed dithiolopyrrolone biosynthetic pathway[17]1.4.1 生物合成基因簇的鉴定然而随着近几年来分子生物学的发展、全基因组测序技术的普及以及生物信息学的进步，许多研究者从土壤链霉菌以及海洋微生物中都陆续克隆到了二硫吡咯酮类化合物的生物合成基因簇。2010年，Li等对产生菌S. clavuligerus基因组序列进行生物信息学分析，找到了一个可能负责holomycin生物合成的基因簇，并且对holomycin的生物合成途径进行了
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q78

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