转AtNHX1-betA-TsVP基因棉花的耐盐性研究和转GhPEAMT-betA基因棉花的获得

发布时间：2020-05-07 02:18

【摘要】：转AtNHX1-betA-TsVP基因棉花耐盐性分析盐渍化是全世界普遍存在土壤问题,很大程度上限制农作物产量。大约全球6%土地受到盐渍化影响并且有扩大的趋势。棉花是全球最重要的自然纤维与主要产油作物来源。在中国目前棉产区主要向西北内陆、濒海盐碱地聚集。提高棉花耐盐性对于推广其在盐碱地中的大量种植及解决“粮棉蔬争地”问题,有着重要的意义。甘氨酸甜菜碱(GB)作为一类的渗透保护物,可以有效地保护作物应对多种非生物胁迫。来自大肠杆菌的betA基因编码的胆碱脱氢酶能够促进胆碱合成GB。从盐芥克隆得到的TsVP基因负责编码H+-Ppase,其定位于植物液泡膜上,能为Na+在液泡中区隔化提供动力进而维持离子平衡。植物液泡膜上存在负责将胞质中Na+逆浓度梯度运输到液泡内的Na+/H+逆向转运蛋白是由NHX1所编码,过表达拟南芥中AtNHX1基因能显著增强植物耐逆性。本实验通过将三个负责两种不同代谢途径的基因共转化到棉花中,以达到获得耐盐性显著提高的棉花新种质的目的。将AtNHX1-betA-TsVP基因利用农杆菌介导法导入棉花中。选取大田盐碱地中农艺学性状表现较佳的三个株系(ABT1、ABT2、ABT3)等T3代植株作为实验材料,以转TsVP基因的T83株系(T6代)、转betA基因(T6代)的B29株系和鲁棉研21号(WT)作为对照,从基因表达水平、盐胁迫下的种子出苗、苗期与蕾期生理生化指标测定、盐碱地农艺学性状考察等诸多角度考察棉花的耐盐性的差异。对转AtNHX1-betA-TsVP基因植株的AtNHX1、betA TsVP基因进行了 PCR检测并利用q-PCR检测了基因的表达水平,结果表明AtNHX1-betA-tSVP基因成功转入棉花中并正常表达。沙培条件下各株系棉花在四叶期开始进行盐处理,分别取250 mM NaC1处理后第0、1、7、14、21天的植株材料测定各项生理状况。研究发现,盐胁迫前各株系棉花在叶绿素含量、植株干重、相对水含量(RWC)、饱和渗透式、Na+、净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、FV/Fm、可溶性糖、离子渗漏、丙二醛含量(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)等指标上无显著差异。盐胁迫处理后,相对于WT和转betA、TsVP基因棉花,转AtNHX1-betA-TsVP基因棉花ABT3具备显著更高叶绿素含量、植株干重、RWC、Na+、Pn、Gs、Fv/Fm、可溶性糖、SOD酶活和显著更低的饱和渗透式、离子渗漏、MDA。表明沙培条件下四叶期到蕾期转AtNHX1-betA-TsVP棉花的耐盐性最佳。水培条件下各株系棉花在四叶期开始进行0 mM、150 mM、250 mM NaCl胁迫,分别取不同浓度NaCl处理后第0、18天的植株材料测定多项生理指标。研究发现,盐胁迫处理前各棉花株系在RWC、饱和渗透式、干重、Pn、Fv/Fm等生理指标上不存在显著差异;盐胁迫处理后,相比于WT和转betA、TsVP基因棉花,转AtNHX1-betA-TsVP基因棉花ABT3具有显著更高的RWC、干重、Pn、Fv/Fm和显著更低的饱和渗透式。表明水培条件下转AtNHX1-betA-TsVP基因棉花的耐盐能力最佳。盐胁迫下种子出苗实验测定了棉花的出苗率、植株株高和干重。结果表明,在0 mM NaCl处理下各株系棉花的出苗率和干重无显著差异;在200 mM NaCl条件下转基因棉花的出苗率、株高和干重显著高于WT,转AtNHX1-betA-TsVP棉花比转betA/TsVP基因棉花具备更高出苗率和植株干重。因此,转AtNHX1-betA-TsVP基因棉花在种子出苗期比转TsVP/betA基因棉花和WT具有更强耐盐能力。东营盐碱地大田条件下,我们对不同棉花株系的大田籽棉产量等农艺学性状、Pn和Fv/Fm进行了测量与分析。数据分析结果表明,转AtNHX1-betA-TsVP基因棉花植株相比于其它株系棉花具有更高Pn、Fv/Fm、籽棉产量和更好的大田农艺学表现。实验结果说明将AtNHX1-betA-TsVP基因转化到棉花中可以很大程度上增强棉花耐盐能力。转GhPEAMT-betA基因棉花植株的获得GhPEAMT基因负责编码磷酸乙醇胺-N-甲基转移酶,能够催化磷酸乙醇胺经过三步甲基化生成磷酸胆碱,是胆碱生物合成关键酶。betA基因负责编码胆碱脱氢酶能够催化胆碱生成甜菜碱醛,其是甜菜碱合成关键酶。将GhPEAMT-betA转化到棉花中有可能增强棉花细胞中甜菜碱的水平,有望增强棉花抗逆能力。本实验将GhPEAMT、betA基因构建到植物表达载体上,利用农杆菌介导法将其转化到棉花细胞中,通过草甘膦初步筛选、PCR鉴定,获得转GhPEAMT-betA基因棉花。
【图文】：

细胞活性,盐胁迫,代谢物,胞质

逡逑图１－１植物细胞中的离子平衡［４３］逡逑ＳＯＳ途径对于植物中Ｎａ＋／Ｋ＋离子平衡的调节至关重要［４４］。ＳＣａＢＰ８通过直接逡逑同ＡＫＴ１邋Ｃ－末段相互作用抑制Ｋ＋离子通道ＡＫＴ１的活性。盐胁迫下，Ｓ０Ｓ２通过逡逑磷酸化ＳＣａＢＰ８与质膜的建立联系［２８，邋４５］。ＳＯＳ２对ＳＣａＢＰ８的磷酸化作用是否能逡逑减少ＳＣａＢＰ８与ＡＫＴ１的相互作用进而释放ＡＫＴ１的活性增加Ｋ＋的吸收来应对逡逑盐胁迫尚不清楚。假设上述过程存在，ＳＯＳ２可通过对ＳＣａＢＰ８和ＳＯＳ１的磷酸逡逑化激活ＡＫＴ１和Ｓ０Ｓ１，从而维持细胞质中Ｎａ＋／Ｋ＋离子平衡。逡逑液泡膜Ｎａ＋区隔化是植物在高盐条件下减少胞质内有毒离子积累一种重要逡逑适应机制。Ｓ０Ｓ２可正向调节液泡膜Ｈ＋－ＡＴＰａＳｅ与Ｎａ＋／Ｈ＋转运蛋白活性以减少胞逡逑质中Ｎａ＋毒害。ＳＣａＢＰ８／ＣＢＬ１０可以与液泡膜上的ＳＯＳ２相互作用［４６］，表明ＳＣａＢＰ８逡逑可能与液泡膜Ｎａ＋区隔化有关。然而，，关于液泡膜ＮＨＸ转运体还存在争议。早逡逑期的研究报告表明ＮＨＸ１与液泡膜Ｎａ＋区隔化和植物盐分耐受性有关ｔ４＇近期有逡逑报告表明ＮＨＸ１和ＮＨＸ２介导Ｋ＋进入液泡；拟南芥《知２双突变体在盐分逡逑敏感程度和Ｎａ＋在液泡中的富集上没有改变［４８，邋４９１。ＮＨＸ１和ＮＨＸ２的Ｋ＋通道活逡逑性是否被胞质中Ｎａ＋浓度变化调节；ＮＨＸ１和ＮＨＸ２是否主要介导Ｋ＋和Ｈ＋交换

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３．１转基因棉花的分子鉴定结果逡逑３．１．１仙ＶＨＺ７、６此４、尸基因的ＰＣＲ鉴定结果逡逑本实验中基因ＰＣＲ扩增片段大小为１５６６邋ｂｐ；从图３－１邋ａ可以看出逡逑ＷＴ和以水为模版的阴性对照中未检测到基因存在，而转逡逑基因棉花株系ＡＢＴ１、ＡＢＴ２、ＡＢＴ３中均检测到Ａ７ＶＨＺ７基因逡逑的存在。基因ＰＣＲ扩增片段大小为９００邋ｂｐ；从图３－１邋ｂ可以看出ＷＴ和以水逡逑为模版的阴性对照中未检测到基因的存在，而转基因棉花株系Ｂ２９和逡逑转基因棉花株系ＡＢＴ１、ＡＢＴ２、ＡＢＴ３中均检测到基因逡逑存在。Ｋ印基因ＰＣＲ扩增片段大小为６５４邋ｂｐ；从图３－１邋ｃ可以看出ＷＴ未检测逡逑到基因存在，而过表达ＫＦＰ基因棉花株系Ｔ８３和转基逡逑因棉花株系ＡＢＴ１、ＡＢＴ２、ＡＢＴ３中均检测到ＫｆＴ基因的存在。逡逑ａ邋Ｍ邋Ｐ邋ＣＫ邋Ｈ２0邋１逦２逦３逦４逦５逦６逦７逦８邋Ｐ邋Ｍ逡逑ｚＢｇｍｍｍｓ逡逑逦逦逦逡逑ｂ邋Ｍ邋Ｐ邋ＣＫ邋Ｈ２Ｑ邋１邋２邋３邋４邋５邋６邋７邋？邋Ｍ逡逑２０００ｂｐｍＭ｜逡逑３００ｂｐ［逡逑２５０ｂｐＰ逦ｈ逦－｜逡逑ｌＯＯｂｐＰ逦＇逡逑Ｃ邋Ｍ邋Ｐ邋ＣＫ邋１邋２邋３邋４邋３邋６邋７８逡逑２０００ｂｐＭ邋＂＾ＪＳｒ；邋｜＿一夂，逡逑ｌＯＯＯｂｐＢ逦：，．，‘？、一＿，－＇，、逦１逡逑７；0ｂｐＥＪ＇逡逑３０Ｃｌｂｐ■、一二】ｒ逦７、‘．：邋ｔ邋１邋丨丨逡逑２５０ｂｐＰ逦
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S562

【参考文献】