EPCR基因敲低的人脐带间充质干细胞治疗博来霉素所致小鼠肺纤维化及机制初探

发布时间：2020-05-07 11:18

【摘要】：目的:观察EPCR基因敲低的人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)对博来霉素所致小鼠肺纤维化的治疗作用,初步探索其可能的机制。方法:根据EPCR基因mRNA序列,合成3条小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)导入hUC-MSCs,通过检测EPCR蛋白表达,筛选干扰效果最佳si RNA。根据最佳siRNA序列构建慢病毒载体,包装重组慢病毒,感染h UC-MSCs,Real-time PCR和Western blot验证敲低效率。将C57BL/6小鼠随机分为5组:空白对照组(Ctrl)、模型对照组(B)、干细胞治疗组(B+MSCs)、敲低组干细胞治疗组(B+shRNA-EPCR-MSCs)、阴性对照组干细胞治疗组(B+shRNA-NC-MSCs)。小鼠10%水合氯醛腹腔麻醉,无创气管插管法分别给予空白对照组生理盐水50μL,其余组给予同等体积博来霉素3mg/kg。建模后第7天,干细胞治疗组、敲低组干细胞治疗组、阴性对照组干细胞治疗组经气管插管给予各自对应细胞悬液5*10~5/50ul/只,空白对照组和模型对照组给予等量无菌生理盐水。造模后第21天处死小鼠并收集肺组织标本,进行HE和Masson染色,Ashcroft评分,Sircol法检测肺内可溶胶原量,以评定不同分组小鼠肺纤维化程度。最后体外构建转化生长因子-β1(transforming growth factor beta1,TGF-β1)诱导干细胞向成纤维细胞分化模型,分别诱导敲低组和阴性对照组干细胞,Real-time PCR和Western blot检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和Ⅰ型胶原(type I collagen,ColⅠ)在诱导前后表达水平,以反映分化程度。结果:以EPCR最佳siRNA序列构建EPCR基因RNAi慢病毒载体,成功减低hUC-MSCs内EPCR的mRNA(P0.001)和蛋白(P0.001)表达。B+shRNA-EPCR-MSCs组小鼠较模型对照组中位生存时间明显延长(P0.05),肺部病理改变较轻,Ashcroft评分较低(P0.05),肺内胶原沉积较少(P0.05)。敲低组干细胞合成的ColⅠ在mRNA和蛋白水平(P0.05)均减少。体外TGF-β1诱导可增加hUC-MSCs内α-SMA、ColⅠ的表达(mRNA水平,P0.05;蛋白水平,P0.05),促进其向成纤维细胞分化。敲低EPCR可部分抑制TGF-β1所致α-SMA及ColⅠ表达增多(mRNA水平,P0.05;蛋白水平,P0.05)。结论:shRNA-EPCR-MSCs可以改善博来霉素所致小鼠肺纤维化,可能与敲低EPCR减少hUC-MSCs内ColⅠ表达,并减弱其向成纤维细胞分化有关。
【图文】：

蛋白表达,量化分析

图 1.1 siRNAs 转入 hUC-MSCs 后 EPCR 蛋白表达的检测1.1 Detection of the protein expression of EPCR after transfection of hUC-MSCs by siRNAs（注：A.EPCR 蛋白表达；B.EPCR 蛋白表达的量化分析a：与对照组比较，P＜0.001；b：与 siRNA-2 比较，，P＜0.001）

序列分析

序列分析
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R575.2

【参考文献】