桑树休眠相关MADS-box基因的功能研究

发布时间：2020-05-08 04:14

【摘要】：植物的开花过程与种群的延续直接相关,精确的开花时间是植物成功繁殖的关键。拟南芥的开花过程主要由光周期途径、春化途径、自主途径、赤霉素途径和年龄途径等调控,其中,春化是指经过冷处理使植物获得或者加速成花的转化的过程。多年生植物通过芽休眠的方式越冬,来年重新进入营养生长和生殖生长周期。春化与休眠过程均需要受冷刺激,并且两个过程都受表观遗传调控,可能具有相似的调控机制。桑树为多年生木本开花植物,广泛分布于亚洲、欧洲、非洲、美国北部和南部地区。桑叶用于家蚕的喂养,桑果则可直接食用或入药,具有较高的药用和保健价值。桑果的果期短,且不易保鲜,因此,早熟或晚熟品种的育成成为果桑育种的重要方向。桑果的早熟和晚熟与桑树休眠打破的时间密切相关。MADS-box蛋白是真核生物中的一类转录因子,该家族基因几乎参与了植物整个生长发育过程,其中包括对休眠的调控。本研究首先从全基因组水平搜查开花相关基因,对MADS-box基因进行系统的生物信息学分析。利用实时荧光定量PCR,对桑树中MADS-box基因的表达模式进行分析,结果表明,MaMADS33(FLC-like)基因在内休眠过程中表达量较高,内休眠解除过程中其表达量降低,表明桑树MaMADS33基因可能与内休眠过程相关。我们分别借助异源过表达、亚细胞定位、双分子荧光互补、酵母双杂交、双荧光素酶报告系统,对桑树休眠相关MADS-box基因进行研究,主要结果如下:1、桑树开花相关基因的鉴定及桑树MADS-box基因生物信息分析通过川桑(Morus notabilis L.)全基因组搜索,总共获得了241个开花相关基因,包含了开花整合因子、光周期途径、春化途径、GA途径、自主途径和年龄途径的关键基因。我们鉴定到8个FT/TFL1同源基因,进化分析表明,FT/TFL1家族基因总共分为四个大支,分别是TFL1,BFT,FT以及MFT。拟南芥中有5个红/远红光受体光敏色素基因,桑树基因组中仅鉴定到3个红/远红光受体光敏色素同源基因,根据序列相似性,分别将其归类于PHYA、PHYB和PHYE。此外,我们没有鉴定到依赖于FRI途径中的FRI直系同源基因,但找到13个FRL同源基因,其中8个FRL基因串联重复的分布于同一scaffold上。借助生物信息学方法,我们在川桑基因组中总共鉴定到54个MADS-box家族基因,分别命名为MnMADS1-54。进化分析表明,54个MnMADS基因包含17个type I基因和37个type II基因。17个type I基因进一步分为11个Mα基因,2个Mβ基因和4个Mγ基因;37个type II基因进一步分为14个亚家族,分别为AGL2,AGL6,SQUA,AG,FLC,AGl12,TM3,AGL17,STMADS11,AGL15,GLO,DEF,GGM13,MIKC*,其中包含3个FLC-like基因(MnMADS7,MnMADS33,MnMADS50)和4个AGL24/SVP-like基因(MnMADS1,MnMADS42,MnMADS43,MnMADS4)。从基因在scaffold上的分布来看,54个MnMADS基因分布于42个scaffold上,其中10个scaffold上存在基因串联重复分布。串联重复序列中包含1对AGL6-SOC1基因和3对SEP-AP1基因,此外,PI、SVP同源基因以及3组Mα基因存在同源基因复制现象。选择压力分析表明,串联重复的Mα亚家族基因在进化过程中受到正选择压力作用。蛋白和基因结构分析表明,54个MADS-box蛋白均含有一个MADS结构域,且大多数type II蛋白具有典型的MIKC结构,同一亚家族基因的基因结构相似,type I蛋白几乎由1个外显子编码,type II型中MICK蛋白则由6个左右的外显子编码。通过转录组数据及荧光定量分析结果表明,ABCDE型基因在花器官组织中表达量较高,暗示了桑树ABCDE型基因在进化过程中结构和功能的保守性。MaMADS33基因在内休眠时表达量较高,内休眠解除时期其表达量降低,暗示其参与内休眠过程。2、桑树AGL24/SVP-like基因功能分析DAM基因为拟南芥AGL24/SVP的同源基因,研究表明,DAM基因参与了多年生植物的休眠过程。我们从桑树资源金墙63(JQ63,Morus alba)中克隆了4个AGL24/SVP-like基因,分别命名为MaMADS1,MaMADS42,MaMADS43,和MaMADS4。通过多物种同源序列进化分析,结果表明,MaMADS1和MaMADS4分别与拟南芥中的SVP和AGL24基因亲缘关系更近。MaMADS42和MaMADS43与乳浆草(Euphorbia esula L.)中的DAM基因聚为一支,所组成的支系与马铃薯(Solanum tuberosum L.)中的StMADS11聚为一个大枝。在烟草叶片细胞中瞬时表达桑树AGL24/SVP-like-GFP融合蛋白,结果表明,MaMADS4,MaMADS42和MaMADS43均定位于细胞核中,MaMADS1除了在细胞核外,在细胞膜以及细胞质中也能检测到荧光信号。拟南芥中过表达桑树AGL24/SVP-like基因,结果表明,过表达MaMADS4基因的拟南芥显著提前开花;过表达MaMADS1则显著延迟开花,并且其花器官发育异常。通过酵母双杂交检测MaMADS1蛋白与桑树和拟南芥中花器官发育相关的A、B和E型蛋白互作,同时验证了MaMADS1与桑树和拟南芥成花相关蛋白的互作关系。结果表明,MaMADS1能够与拟南芥B和E型蛋白互作,尤其与E型蛋白相互作用更强,MaMADS1能够与桑树A、B和E型蛋白均相互作用;MaMADS1能够与拟南芥和桑树中的成花相关蛋白FLC、SOC1和AGL24/SVP相互作用,MaMADS1自身还可形成同源二聚体。以上结果暗示了桑树MaMADS1基因在花器官的发育及成花转化中功能的保守性。荧光定量分析结果表明,MaMADS1在一年生皮、成熟叶、顶芽、成熟叶柄以及苞叶中的表达量相对较高,尤其在成熟叶柄和苞叶中最高。MaMADS42和MaMADS43的表达模式极其相似,均在一年生皮以及成熟叶中表达量较高。MaMADS4基因的表达与MaMADS1类似,在一年生皮、成熟叶柄、成熟叶以及苞叶中表达相对较高,在其他组织中表达较低,与MaMADS1相比,MaMADS4在顶芽中的表达相对较低。在一周年的花芽中的表达模式分析表明,桑树AGL24/SVP-like基因的表达模式趋于一致,在七月份达到最高峰,随后逐渐下降,暗示了桑树AGL24/SVP-like基因参与了类休眠的过程。3、桑树FLC-like基因的功能分析我们在桑树JQ63中克隆了3个FLC-like基因,分别命名为MaMADS33,MaMADS50和MaMADS7。序列分析表明,MaMADS33和MaMADS50均含有较完整的MIKC结构,MaMADS7蛋白的C端保守度较低,此外,MaMADS33蛋白的MADS结构域的前端还包含一段由31个氨基酸组成的序列。我们用多个物种的总共84条FLC同源蛋白序列重构进化树,结果表明,MaMADS33/50/7聚为一支,且与酸浆属(Mimulus)等FLC同源蛋白亲缘关系更近。在烟草叶片细胞中瞬时表达桑树FLC-like-GFP融合蛋白,结果表明MaMADS7和MaMADS50均定位于细胞核中,MaMADS33主要定位于细胞核中,在细胞膜和细胞质中也能检测到信号。在拟南芥中过表达桑树FLC-like基因,结果表明,与野生型相比,三个基因过表达株系均一定程度延迟开花,且在过表达株系中,拟南芥的FT和SOC1基因均被下调表达。暗示了桑树FLC-like基因在开花调控过程中起抑制作用,与拟南芥FLC基因对开花的调控相似。本研究中,我们在桑树MaFT基因的启动子区域发现4个CArG盒。借助双荧光素酶报告系统验证桑树FLC-like对MaFT基因启动子的调控,结果表明,MaMADS33、50和7均能够直接或者间接地结合MaFT启动子区域,并显著地抑制其下游报告基因的表达。在一周年的花芽中的表达模式分析表明,MaMADS33基因在4月到9月期间表达呈上下波动,11月时表达出现峰值,其表达量随后逐渐降低,到2月和3月时降到最低。MaMAD50则在9月表达量最高,进入11月后,其表达量也相对降低。MaMADS7基因则在5月时表达量最高,其余时期呈现波动。MaFT基因在6到10月的表达量均较高,11月时表达量急剧降低,随后在2月和3月时表达量有所回升。在内休眠周期中,MaMADS33与MaFT基因呈相反的表达模式,并且与内休眠过程相关。MaMADS33基因在冷处理10天时,表达量出现峰值,随后表达量降低,与MaFT基因的表达模式相反。用脱落酸处理花芽,MaMADS33和MaFT基因的表达量上升,MaMADS33随着处理时间增加,其表达量持续增加,而MaFT的表达则逐渐降低。结合双荧光素酶报告系统实验结果,进一步暗示MaMADS33通过抑制MaFT基因的表达参与内休眠过程。我们在不同需冷量的桑树资源中观察MaMADS33基因的表达,结果表明,需冷量与MaMADS33基因的表达量呈正相关。为了进一步验证MaMADS33基因的功能,我们构建了桑树酵母双杂交文库,用MaMADS33蛋白作为诱饵,筛选到20个阳性克隆,其中包含了MaWAP18蛋白。研究表明,MaWAP18编码了冬季积累蛋白,MaWAP18基因在内休眠时期的mRNA和蛋白水平均较高。我们克隆了MaWAP18的全长,将诱饵蛋白和目的蛋白交换验证,结果表明,MaMADS33和MaWAP18蛋白在酵母双杂交系统中相互作用。通过双分子荧光互补实验进一步验证两个蛋白的互作关系,结果表明,在保卫细胞中的荧光信号最强。综合上文休眠相关MADS-box基因功能研究结果,我们认为桑树中DAM-like基因可能参与类休眠过程;FLC同源基因MaMADS33能够响应低温,在内休眠解除时表达降低,且在内休眠过程中与MaFT基因具有相反的表达模式,此外,MaMADS33能够与冬季积累蛋白MaWAP18相互做用。本研究结果为FLC同源基因参与内休眠过程提供了新的数据,并且支持春化途径和内休眠过程具有相似的调控途径的推测。
【图文】：

成花,拟南芥,转化过程,途径

第一章文献综述第一章文献综述1.1 植物开花调控机制开花是植物由营养生长向生殖生长过程转变的标志，是通过整合环境因素和内源性信号共同调控而实现。精确的开花时间是植物生长繁殖和物种进化的关键在拟南芥中，至少有六个通路调控成花转变过程，分别是光周期途径（Photoperipathway），自主途径（Autonomous pathway），春化途径（Vernalization pathway年龄途径（Age pathway），赤霉素途径（Gibberellins pathway），以及环境温度途（Ambient temperature pathway）[1]。这些通路彼此相互独立，又相互影响，形成反馈的调控网络，如图 1.1 所示。

春化,基因,成花,响应元件

第一章文献综述的两个 CO 响应元件（CORE）进而启动 FT 转录[24]，另外，FT 启动子区域相互依赖的调控区域对传达光周期非常重要[25]。.2 春化途径春化（vernalization）被学者定义为通过冷处理使植物获得或者加速成花能力[26]。FLOWERING LOCUS C（FLC）基因由 7 个外显子组成，基因内个内含子序列较长，该基因编码含有 MADS 结构域的抑制开花的转录因子南芥中为开花过程的强抑制因子，FLC 基因是春化途径的关键基因，，春化即为沉默 FLC 基因的过程[27]。春化过程对 FLC 的调控总共分为三个阶段：，FLC 的激活，达到建立春化作用的条件，春化过程中，FLC 表达降低，色体的构象改变，春化后，成花转化之前，表观遗传及 VERNALIZATSENSITIVE 3（VIN3）基因的高表达使得 FLC 维持沉默状态[27-28]，如图 1.
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943.2;S888.2

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