BoMS1和BoAOS基因控制甘蓝雄性不育的功能研究

发布时间：2020-05-09 19:24

【摘要】：结球甘蓝(Brassica oleracea L.var.Capitata)属十字花科芸薹属甘蓝种的一个变种,是典型的异花授粉植物,长期以来利用其花期自交不亲和的特点进行甘蓝优势育种,但因自交不亲和系的配制杂交率难以达到100%而存在假杂种问题,且繁殖依赖人工蕾期授粉,效率低,成本高。进入本世纪以后,甘蓝优势育种逐渐转向雄性不育系的选育和利用。扩大雄性不育源,创制雄性不育的突变体材料成为甘蓝育种的重要内容。模式植物拟南芥中基于AG(AGAMOUS)基因通路下的花粉发育调控网络日臻清晰,MALE STERILITY1(MS1)是该网络中的一个关键基因,其编码PHD-finger结构转录因子,在拟南芥、油菜、水稻、大麦中被发现参与雄性不育调控。茉莉酸合成代谢除参与自身防御系统外,在花药的开裂方面起着重要的作用。目前,甘蓝基于雄性不育途径的优势育种主要利用来自萝卜的ogura-CMS细胞质雄性不育,存在不育源单一的问题,为扩大甘蓝雄性不育资源,同时解决其自交不亲和影响繁殖的问题,本文应用RNA干扰技术和CRISPR/Cas9技术对BoMS1基因、BoAOS基因和自交不亲和的关键基因BoSRK基因协同调控及编辑突变,创制甘蓝与保持系杂交亲和的雄性不育材料。本研究获得的结果如下:1.构建针对拟南芥突变体ms1ms1的功能回复载体pCA13BarPMS1MS1和用于转化甘蓝的BoMS1基因的RNAi干扰载体pCA13BarPMS1iMS1。通过花序侵染法获得拟南芥T1代植株,经500ppm的PPT筛选后获得12株转基因拟南芥。经过基因型鉴定,得到3株基因型背景为ms1/ms1的pCA13BarPMS1MS1转基因拟南芥,结果发现转基因植株在开花以后花粉正常,其余表型也与基因型为MS1/ms1的拟南芥无差异。与对照ms1ms1不育株相比,角果正常伸长并膨大。pCA13BarPMSiMS1表达载体通过农杆菌介导的转化转入甘蓝中,获得转基因甘蓝7株,其中1株为完全不育,表现为花柱突出,花丝短缩,花药肥大而无花粉,其余表型与可育株一致。其他植株尽管有花粉,经0.5%的TTC染色后显示活力存在不同程度的降低。上述结果证明甘蓝BoMS1基因卷入甘蓝育性的调控。2.构建BoMS1基因和BoSRK基因RNAi双干扰载体pCA13BariMS1/iSRK、BoMS1基因和BoSRK基因双敲除的载体pCas-tBoMS1-ABCD/tBoSRK-ABCD转化甘蓝自交不亲和系“F416”(SRK3单倍型)。获得pCA13BariMS1/iSRK转基因植株21株,除1株外,其他植株开花后花药干瘪,无花粉,其他表型与野生型无差异。1株转基因植株有花粉但花粉发白,经0.5%的TTC染色后发现多数花粉粒无活力。获得pCas-tBoMS1-ABCD/tBoSRK-ABCD转基因植株18株,其中有6个单株发生了双基因敲除,针对BoMS1基因的突变频率为33.33%,BoSRK基因的突变频率达到72.22%,双突变的频率为33.33%。双敲除的转基因植株除1株死亡外,其余5株转基因植株正常开花。早期低温(20℃)下,花药在花瓣开放前就停止生长,花药败育,无花粉;后期温度回升到25℃后,有4株花药发育正常,花粉出现程度不同活性下降,但1株仍表现花药彻底败育,无花粉产生。通过花粉原位萌发的荧光显微观察检测pCA13BariMS1/iSRK和pCas-tBoMS1-ABCD/tBoSRK-ABCD转基因植株(花期和蕾期与野生型杂交)的自交亲和性,结果显示蕾期杂交的花粉管萌发情况与野生型蕾期自交无异,而花期杂交的花粉管萌发明显优于野生型花期自交。结果表明同时进行BoMS1基因和BoSRK基因调控能够产生雄性不育且与保持系杂交亲和的甘蓝材料。3.构建BoAOS基因和BoSRK基因RNAi载体pCA13BariAOS/iSRK和BoAOS基因及BoSRK基因双敲除载体pCas-BoAOS-AB/tBoSRK-ABCD转化甘蓝下胚轴。获得9株pCA13BariAOS/iSRK转基因植株,为确定针对BoAOS基因的干扰效果,对2株转基因植株接种软腐病前后的BoAOS基因和BoOPR3基因进行RT-PCR分析,结果显示:野生型植株的BoAOS基因和BoOPR3基因的表达在接种后有所上升,但转基因植株在接种后两个基因的表达量不升反降,证明对BoAOS基因的干扰有效。但开花后植株花药发育正常,花粉有活力,部分植株花粉活力有所下降,与野生型植株花期杂交亲和性提高。获得pCas-BoAOS-AB/tBoSRK-ABCD转基因植株50株,其中7株发生双基因敲除。针对BoAOS基因的突变频率为14.00%,BoSRK基因的突变频率为86.00%,双突变的频率为14.00%。7株双敲除的转基因植株中1株因病而亡,其余6株正常开花。开花早期,花粉散粉异常,对其花粉活力鉴定显示花粉活力低于野生型;后期花粉的散开正常,但单株之间的花粉活力仍然存在差异。通过花粉原位萌发荧光显微观察检测pCas-BoAOS-AB/tBoSRK-ABCD转基因植株(花期和蕾期与野生型杂交)的自交亲和性,结果显示花期杂交的花粉管萌发明显强于野生型植株的花期自交。
【图文】：

示意图,隐性核不育,植株,示意图

西南大学硕士学位论文粉可以繁殖保持系和雄性不育系。2002 年，Perez-Prat 等（Perez-Prat & van LookerenCampagne，2002）提出了一套基于核基因控制雄性不育完全保持的设想。该设想的核心是将相应的育性恢复基因（针对显性不育/隐性不育）、花粉致死基因和育性标记基因紧密连锁并导入对应的纯合核不育系中，建立相应的保持系，实现核不育系的 100%保持。基于这些设想，杜邦先锋公司设计了玉米种子生产技术，

模型图,模型,不育系,隐性

第 1 章文献综述只适用于保持系栽培，而保持系的栽培只需小面不需要转基因监督。目前该技术已成功地实现了ang et al.，2016）中保持系和不育系的简便繁殖，隐性不育系的保持，主要是因为在甘蓝中控制隐的隐性不育系还未建立。关基因研究器官建成的 ABCE 模型，BCE 类基因共同决定雄发育由 ABC 三组同源异形基因控制（Coen et alAPETALA1（AP1）和APETALA2（AP2），B组基因包LATA（P1），，C 组基因包括 AGAMOUS（AG）和
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S635

【参考文献】