小麦TaMOC1基因的启动子分析及CRISPR-Cas9突变体的获得

发布时间：2020-05-09 17:46

【摘要】：小麦(Triticum aestivum L.)是主要的粮食作物。分蘖是包括小麦在内的单子叶禾本科植物最重要的农艺性状之一,直接影响小麦结实进而影响单产,因此小麦的分蘖研究具有重要的发育生物学意义。水稻(Oryza sativa L.)的MOC1基因是控制其分蘖的发生及分蘖芽生长的关键基因。本课题组前期已分离了TaMOC1基因,并对其表达模式及功能进行了初步探究。基因表达的调控包括转录水平的调控、转录后水平的调控和翻译后蛋白水平的调控等,但转录水平的调控是最重要的,而启动子的调控作用在转录水平上的调控是最重要的。因此,启动子的序列、结构及其功能元件的研究对于了解基因表达调控原理非常重要。在本课题的研究中,我们克隆了TaMOC1的启动子序列并对它的序列结构及作用元件进行初步分析。同时,为了深入探究TaMOC1的功能,我们利用CRISPR/Cas的方法构建TaMOC1定点突变的表达载体,以小麦幼胚为材料,进行小麦遗传转化实验。具体研究结果如下:(1)半定量实验的分析结果显示TaMOC1-7A、TaMOC1-7B、TaMOC1-7D在根、茎尖、叶和小穗中均有表达,其中在茎尖中TaMOC1-7B表达量较高。(2)TaMOC1-7A、TaMOC1-7B、TaMOC1-7D的启动子序列顺式作用元件的分析结果显示它们启动子中含有多种调控元件。分蘖受多种因素影响。因此我们推测:TaMOC1启动子可能通过多种激素诱导调控TaMOC1表达,并与逆境胁迫信号途径有关,并且TaMOC1启动子可能通过与分生组织表达有关的顺式调控元件参与TaMOC1调控小麦分蘖。(3)P_(TaMOC1-7D)::GUS、P_(TaMOC1-7D)P1::GUS、P_(TaMOC1-7D)P2::GUS拟南芥遗传转化实验的结果表明CAT-box调控元件决定了TaMOC1的表达部位,对于TaMOC1启动子的活性有重要意义。(4)我们得到了5株pBUE411-TaMOC1-Cas9 T0代转基因植株,植株育性较差。同时,我们已获得部分T1代转基因植株测序结果,测序结果表明TaMOC1突变体植株的靶位点序列处部分核苷酸序列发生了改变,造成其氨基酸序列发生了变化,进一步的定量PCR结果显示TaMOC1的表达量明显下调。下一步我们将对P_(TaMOC1-7D)::GUS转基因T2代植株进行大量GUS染色及相关组织切片分析,进一步确定TaMOC1的表达模式。此外,我们将对pBUE411-TaMOC1-Cas9转基因株系进行大田种植,分别对其冬前及拔节期分蘖情况、穗发育及结实情况进行观察,确定TaMOC1对小麦分蘖的作用。
【图文】：

结构图,位点,结构图,外源

图 1-1 CRISPR 位点结构图Fig. 1-1 CRISPR site map/Cas 系统的工作原理物 RNA 干扰（RNAi）原理相似，CRISPR/Cas 系统，通过的表达被沉默（Zhang et al., 2016）。首先，CRISPR/Cas 系码的蛋白的协助下，找到与间隔序列互补的外源 DNA 序列r）。原间隔序列的选取并不是随机的，它的两端都有几个非常序列临近基序的 PAM（protospacer adjacent motif，PAM）（通常由 NGG 三个碱基构成（N 为任意碱基）（Feng et al., 2合物将原间隔序列从外源 DNA 剪切下来，并在其他酶的协序列的前导区的下游（Liang et al., 2018）。随后，，DNA 将打段新的间隔序列就被添加到了基因组 CRISPR 序列。然后，调控下合成 pre-CRISPR-derived RNA（pre-crRNA）和 tran

茎尖,小穗原基,小麦,启动子分析

小麦 TaMOC1 基因的启动子分析及 CRISPR-Cas9 突变体的获得3 结果与分析3.1 TaMOC1-7A、TaMOC1-7B、TaMOC1-7D 的表达模式分析小麦 TaMOC1-7A、TaMOC1-7B、TaMOC1-7D 三个基因来源于不同的祖先，其表达模式可能存在差异。我们选取了幼根、幼叶、三叶一心时期的茎尖及小花小穗原基分化期的小穗原基为材料，对 TaMOC1-7A、TaMOC1-7B、TaMOC1-7D 分别了设计特异引物RTQPTaMOC1-7A-F/RTQPTaMOC1-7A-R 、 RTQPTaMOC1-7B-F/RTQPTaMOC1-7B-R 和RTQPTaMOC1-7A-F/RTQPTaMOC1-7A-R 通过半定量实验对它们进行表达模式分析，结果显示TaMOC1-7A、TaMOC1-7B、TaMOC1-7D 在根、茎尖、叶和小穗中的表达模式均有表达，其中在茎尖中 TaMOC1-7B 表达量最高（图 3-1）。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943.2;S512.1

【参考文献】