沉默CDC25A基因后肝癌HepG2细胞差异表达基因的筛选

发布时间：2020-05-11 19:08

【摘要】：目的:构建稳定沉默细胞分裂周期蛋白25A(CDC25A)基因的人肝癌HepG2细胞模型。方法:通过构建能够沉默CDC25A基因表达的慢病毒RNA干扰载体,感染人肝癌HepG2细胞,再采用实时荧光定量PCR及Western blot方法验证该基因的沉默效率。结果:构建出稳定沉默CDC25A基因的人肝癌细胞,经检测其CDC25A基因mRNA及蛋白质的表达水平均呈下调,且CDC25A基因的沉默效率在50%左右。结论:利用慢病毒载体和RNA干扰技术,可以成功构建稳定沉默CDC25A基因人肝癌HepG2细胞株。目的:应用基因芯片技术研究沉默CDC25A基因后Hep G2细胞的差异基因表达,寻找与CDC25A基因相关的上下游基因。方法:采用Affymetrix人基因表达谱芯片,筛选沉默CDC25A基因后Hep G2细胞的差异表达基因,进一步行IPA(Ingenuity Pathway Analysis)分析。采用实时荧光定量PCR验证芯片结果中部分细胞周期相关差异表达基因的表达水平。结果:通过Affymetrix人基因表达谱芯片筛选,在沉默CDC25A基因后的人肝癌Hep G2细胞中,显著差异表达基因共有1453个,其中上调基因有789个,下调基因有664个。基于IPA软件,对显著差异表达基因进行经典信号通路富集,结果发现显著差异表达基因主要涉及IL-6信号通路、细胞周期通路、P53信号通路、PI3K/AKT信号通路、Wnt/β-连环蛋白信号传导、c AMP介导的信号通路、Toll样受体信号通路等。其中IL-6信号通路被显著抑制,细胞周期通路亦被抑制。另外,疾病与功能分析显示Progression of tumor被显著抑制。q RT-PCR检测证实,在沉默CDC25A基因的肝癌Hep G2细胞中,CCND1、CDKN1A、CDC42、IL6、MAP4K4和CXCL8等细胞周期通路相关基因均表现下调,与基因芯片结果一致。结论:采用人基因表达谱芯片,成功筛选出了沉默CDC25A基因后人肝癌Hep G2细胞中细胞周期相关的差异表达基因,为探究CDC25A基因影响肝癌细胞生长提供了线索。
【图文】：

图 1-1 RNAi 慢病毒的构建包装流程图Figure1-1 The flowchart of RNAinterference lentiviral vector construction and packing其中对上海吉凯基因公司构建的慢病毒载体中的 PCR 阳性克隆进行测序，经过测序序列比对，结果显示其与本课题组前期验证所得的干扰靶点一致，如图 1-2。

图 1-1 RNAi 慢病毒的构建包装流程图Figure1-1 The flowchart of RNAinterference lentiviral vector construction and packing其中对上海吉凯基因公司构建的慢病毒载体中的 PCR 阳性克隆进行序，经过测序序列比对，结果显示其与本课题组前期验证所得的干扰靶一致，如图 1-2。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7

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本文编号：2658925