红苞凤梨VIGS基因沉默体系的建立及POR基因的克隆与功能验证

发布时间：2020-05-12 06:33

【摘要】：红苞凤梨(Ananas comosus var.bracteatus)由于其叶片嵌合形状多样且明显,成为一种重要的新型观赏植物。嵌合性状在组织培养过程中很不稳定,再生植株中嵌合型植株数量稀少。探究叶色镶嵌的形成机理,对提高繁育过程中嵌合性状的稳定性有着重要的意义。本文通过组织培养得到嵌合性状分离的全白植株和全绿植株,通过分析两种植株光合色素合成相关生理指标和基因表达的差异,筛选出导致叶片白化的关键基因为POR基因。通过建立VIGS基因沉默体系,得到一种快速获得转基因植株鉴定基因功能方法。并对POR基因进行了克隆、表达分析和功能验证,探究其对红苞凤梨叶片白化的影响,为深入分析红苞凤梨白化细胞失绿突变的分子机理提供理论依据,对提高红苞凤梨嵌合性状的稳定性,促进红苞凤梨的工厂化育苗具有重要的实践意义。获得的主要研究结果如下:1通过对EF1、UBQ、ACT、GADPH、Histone、TUA、TUB、18S、elf-5A、α-tubulin10个候选基因在红苞凤梨不同生长阶段、全绿和全白叶样品中进行RT-q PCR表达模式分析,筛选出红苞凤梨不同生长发育时期最适内参基因是Histone和α-tubulin,18s、EF1和α-tubulin的内参组合在全绿苗和全白苗的对比分析时最理想。采用Pet F基因验证筛选结果,证明所选的内参基因合适。2以红苞凤梨全绿植株和全白植株叶片为材料,通过RNA-seq测序,经COG、GO和KEGG功能注释分析,发现DEGs主要在叶绿体发育、叶绿素合成和光合作用途径富集。而叶绿素合成代谢过程中有13个差异表达基因,RNA-seq和Real time q PCR分析表明,13个DEGs中仅2个POR基因在全白植株中下调表达。POR基因可能是红苞凤梨叶片白化细胞失绿突变的关键基因。3测定了红苞凤梨组培全白和全绿植株的叶绿素合成中间代谢产物及叶绿素的含量。全绿叶片中Pchlide的含量是全白叶片的4倍,经原叶绿素酸酯氧化还原酶(POR)的催化,全绿叶片中Chla的含量是全白叶片的30倍。结合转录组测序结果进行分析,推测POR基因可能是关键基因,POR基因编码的原叶绿素酸酯氧化还原酶抑制可能是导致是细胞失绿白化的关键原因。4克隆得到2个POR基因的c DNA序列,分别命名为POR1和POR2,两个基因的ORF序列长度分别为1167bp和1218bp,分别编码388和405个氨基酸。导入NCBI进行Blast比对,确定两个基因均是POR基因,属于短链脱氢酶(c-like SDR)家族。这两条核苷酸序列的同源性为73.81%,由碱基推导的氨基酸序列同源性为74.08%。将氨基酸序列与39个不同植物的不同类型POR基因的氨基酸序列进行比对,并建立系统进化树,推测POR1可能为红苞凤梨的PORB基因,POR2为红苞凤梨的PORA基因。5选取PDS基因作为指示基因,使用烟草脆裂病毒为载体,在红苞凤梨中建立VIGS基因沉默体系。构建基因沉默载体PDS-TRV2,利用农杆菌GV3101介导将沉默载体PDS-TRV2和TRV2空载注射红苞凤梨全绿苗。经PCR检测确定病毒在植物内复制并转移,对沉默后的红苞凤梨叶色进行比对,发现转沉默载体的红苞凤梨(Si)和转沉默载体的隔叶(Si-Ge)叶色轻微偏黄,对基因沉默的红苞凤梨类胡萝卜素含量分析表明,Si组和Si-Ge组红苞凤梨类胡萝卜素含量低于阴性对照组(CK)和阳性对照组(P),说明成功构建红苞凤梨VIGS体系。6使用构建成功的VIGS体系,分别选取POR1、POR2中各230bp和298bp保守序列,分别构建沉默载体POR1-TRV2和POR2-TRV2,利用农杆菌GV3101介导将两个POR基因沉默载体和TRV2空载注射红苞凤梨全绿苗。RT-q PCR检测发现转沉默载体的红苞凤梨(Ti)POR基因表达量低于阴性对照组(CK)和阳性对照组(P)。对沉默后的红苞凤梨叶色进行比对,Ti1组和Ti1-Ge组红苞凤梨叶色总体偏黄,且Ti1组和Ti1-Ge组叶绿素含量相较两个对照组下降30%,说明Ti1组叶绿素合成受阻;Ti2组和Ti2-Ge组红苞凤梨叶色与两个对照组相近,且Ti2组和Ti2-Ge组叶绿素含量与两个对照组差异不显著,说明Ti2组叶绿素合成未受太大影响。推测POR1基因可能在叶片叶绿素合成过程中发挥较重要的作用。
【图文】：

被子植物,叶绿素,生物合成途径

尤其在植物绿色果皮和叶片中含量极高，在植物进行光合作用时发挥着重要的作用[41]。叶绿素的合成经过一系列复杂的酶促生化反应（图 1-1），简单来讲是由 L-谷氨酸-tRNA 经过多步反应形成叶绿素 a，最终氧化形成叶绿素 b[42]，有15个酶参与叶绿素生物合成的15步反应，共27个基因来调控这些酶的合成[43]（表 1-1），目前，这 27 个基因基本可以在拟南芥[44]、烟草[45]、大豆[46]、大麦[45]和豌豆[47]等植物中分离出来。叶绿素生物合成中的每一个环节都至关重要，某个基因发生突变或某个环节出现差错，都会影响叶绿素的合成[48]。计玮玮研究吊兰叶绿素合成过程发现，粪卟啉Ⅲ合成 Mg-原卟啉 IX 受阻，致使叶片白化且该部分叶绿素 a 含量显著低于正常绿色部分[49]；Liu 等发现水稻黄化叶片叶绿素含量降低，是由于 HEMA 基因的突变，影响谷氨酰-1-半醛合成，而产生黄化[50]；刘彩云所研究的白肋型烟草，在叶绿素合成过程中受阻于粪卟啉Ⅲ和原卟啉 IX 之间，导致该型烟草与正常绿色烟草不同[51]。

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图 1-2 病毒诱导基因沉默机制[62]Fig1-2 The mechanism of VIGS[62] 影响 VIGS 的因素1 寄主因素一病毒的侵染和移动效率对不同植物或者同一种植物的不同品种均不。由于每一种病毒有一定的寄主范围，寄主植物的不同需要开发的病毒载。Holzberg 利用大麦条纹花叶病毒（Barley stripe mosaic virus，BSMV，首次成功抑制单子叶植物大麦的 PDS 基因，在小麦上也得到应用[63]明，本生烟（N.benthamiama）成为一种模式植物，是由于很多病毒可内高水平积累并转移，深入探索发现本生烟中 RDR1 基因发生突变，该变导致抗病毒功能减弱，并且本生烟中缺少一种水杨酸，，这些可能使得
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S682.36

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