大豆GmPKS4基因的表达分析及互作蛋白鉴定

发布时间：2020-05-13 02:02

【摘要】：PKS(PKS,protein kinases)也称CIPK(CIPK,CBL-interacting protein kinases),编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,与类钙调磷酸酶B蛋白(CBL,Calcineurin B-like protein)相互作用,在植物多种逆境信号转导中发挥重要的调控作用。为了对大豆GmPKS4基因进行初步鉴定,分析了该基因在大豆不同组织的表达情况;构建了植物表达载体明确GmPKS4在亚细胞水平上的定位;构建原核表达载体,成功诱导表达了GmPKS4蛋白;利用酵母双杂交技术,鉴定了与GmPKS4相互作用的蛋白;构建植物超表达载体通过花絮浸染法获得超表达GmPKS4的拟南芥,主要实验结果如下:1.通过qRT-PCR方法检测大豆GmPKS4基因在大豆不同组织的表达情况,结果表明大豆GmPKS4基因在大豆的根、茎、叶和花中都有表达,叶中表达量最高,在大豆不同时期胚中,在早期胚中表达量较低,50 d胚中表达量最高,在成熟大豆籽粒中表达量又减少。2.构建植物表达载体pCAMBIA1302-GmPKS4,通过注射烟草叶片的方法实现GmPKS4基因在烟草叶肉细胞中的瞬时表达,激光共聚焦荧光显微镜下观察表明GmPKS4定位在细胞膜和细胞核上。3.构建原核表达载体pGEX4T-3-GmPKS4,转化大肠杆菌感受态Transetta(DE3),确定最佳诱导条件为28℃,0.2 mM IPTG,时间为4 h,经Western blotting检测,在74 kDa处有一条明显的特异条带,表明大豆GmPKS4蛋白诱导表达成功,为该蛋白后续的纯化奠定了基础。4.构建了诱饵表达载体pGBKT7-GmPKS4和猎物载体pGADT7-GmSNF4。实验表明大豆GmPKS4基因对酵母菌没有毒性;pGBKT7-GmPKS4没有自激活作用;通过酵母双杂交实验说明GmPKS4和GmSNF4间存在相互作用。5.构建植物超表达载体pBASTA-GmPKS4,通过蘸花法将GmPKS4转入到野生型拟南芥中,获得了9个株系T1代阳性植株,对T2代阳性植株进行分离比检测,发现3个株系符合孟德尔分离定律,为GmPKS4基因的表型分析提供了前期基础。
【图文】：

响应模型,盐胁迫

抗高盐胁迫[24,25]，CBL-CIPK 信号通路参与了高生物胁迫（如图 1.1）。类钙调磷酸酶 B 样蛋白（Ca作用蛋白激酶（CBL interacting protein kinase）都的上游或下游靶蛋白，从而使植物具有应对外界胁用方式，其中包括：一个 CBL 只能与一个 CIPK作用，或者多个 CBL 只能与一个 CIPK 相互作用，6 种 CIPK，有 10 种与 CIPK 相互作用的 CBL 蛋白位置是重要的钙贮存部位，有利于 CBL-CIPK 复合形成特定的网络应答系统[29-31]。小麦虽然是重要主，所以对小麦 CBL-CIPK 功能研究较少。目前已知IPK 蛋白，小麦中的 TaCBLs 与 TaCIPKs 形成的）和冷（4℃）胁迫都有响应，在胁迫下，表达量PK 基因（GmCIPK1 至 GmCIPK52），大部分 CIPK达[35]。

结构域,共有序列,钙离子浓度,亲和力

基酸残基 DKDGDGKIDFEE 的共有序列[41]。1（X），3（Y），5（（-Z）位置的氨基酸负责与 Ca2+结合，EF1 在 X 和 Y 位置处插入置结构的变化随之产生与 Ca2+结合的亲和力变化[42]。由于 EF 手使其能够灵活适应钙离子浓度的变化[43]。CBL 结构[44]（如图 1
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943.2;S565.1

【参考文献】