拟南芥抗逆相关泛素连接酶SINA2的调控分析及小麦SINA同源基因的克隆

发布时间：2020-05-13 04:32

【摘要】：干旱、盐、极端温度等非生物胁迫严重影响植物的生长和发育。植物在长期的进化过程中形成了复杂而精准的信号网络,可以感知外界信号并做出响应。在非生物胁迫下,植物可以调控胁迫相关基因的表达,从而提高植物的抗性。探究植物胁迫响应机制对于提高植物抗性具有十分重要的作用。植物泛素连接酶参与了多种信号传导途径。SEVEN IN ABSENTIA(SINA)首次在果蝇中被发现,参与果蝇眼睛的形成。SINA是一类含有RING保守域的泛素连接酶,RING保守域对于SINA的泛素连接酶活性具有决定性作用。拟南芥中共发现18个SINA-like蛋白,其中SINA2不含有该家族其它成员共有的RING保守域。本研究以拟南芥为研究材料,探究SINA2在非生物胁迫条件下的响应;通过原核表达系统获得His-SINA2融合蛋白,该蛋白在体外具有泛素连接酶活性;通过酵母双杂交系统筛库,获得SINA2的互作蛋白CDKG1,进一步研究SINA2与CDKG1之间的关系;分析CDKG1在非生物胁迫下的响应及其功能;研究同时克隆了小麦SINA同源基因TaSINA1,分析其进化关系及表达特性。主要得到以下结果:1、氨基酸序列比对发现SINA2在N端缺失RING保守域,而含有一个不完全保守的B-box2保守域;进化树分析发现SINA2与其它SINA蛋白的亲缘关系较远,其通过原核表达系统获得His-SINA2融合蛋白;His-SINA2在体外可以催化自身泛素化,对于UbcH5a具有特异性。2、SINA2定位在细胞核和细胞质中;在各个器官中均有表达,在花和果荚中的转录水平最高;SINA2在干旱、盐胁迫和ABA处理下的转录水平均有提高;sina2突变体对干旱、盐胁迫和ABA处理十分敏感,发芽率和子叶展开率均明显低于野生型。3、通过酵母双杂交筛库获得SINA2的互作蛋白CDKG1;通过原核表达系统获得MBP-CDKG1,在体外SINA2可以与MBP-CDKG1结合;将表达YFPN-SINA2和YFPC-CDKG1融合蛋白的载体通过农杆菌注射法转化烟草叶片表皮细胞,在细胞核中发现黄色荧光信号。4、CDKG1具有磷酸化活性,在体外可磷酸化SINA2;重组蛋白His-SINA2在原核表达过程中已被磷酸化,λ蛋白磷酸酶可以去除SINA2的磷酸化,而CDKG1可以恢复SINA2的磷酸化水平;CDKG1磷酸化SINA2增强其泛素连接酶活性;去磷酸化的SINA2失去泛素连接酶活性,CDKG1磷酸化去磷酸化的SINA2可以恢复其活性。5、CDKG1含有一个保守Ser/Thr蛋白激酶保守域,与其它物种CDKG1具有较近的亲缘关系,定位于细胞核中;CDKG1在拟南芥幼苗以及根、茎、叶、花和果实中均有表达,在花和果荚的表达量最高;CDKG1受干旱、盐胁迫和ABA处理诱导表达;CDKG1过表达植株在干旱、盐胁迫和ABA处理下的发芽率和子叶展开率明显高于野生型,而cdkg1突变体对于胁迫十分敏感,其发芽率和子叶展开率低于野生型;胁迫相关基因在不同株系中的表达发生了改变。6、比对发现小麦三个SINA同源基因,分别命名为TaSINA1、TaSINA2和TaSINA3。氨基酸序列分析表明小麦三个SINA蛋白N端含有保守的RING保守域;其中TaSINA1定位在细胞核和细胞质中,且该基因受干旱、盐胁迫和ABA处理诱导表达。
【图文】：

第一章 文献综述 第一章 文献综述1.1 泛素-蛋白酶体途径的组成泛素-蛋白酶体途径（UPS）是真核生物调控蛋白降解和功能的重要系统。该系统是靶蛋白与多个泛素分子共价结合，形成靶蛋白多聚泛素链，被 26S 蛋白酶体识别并降解的过程。泛素-蛋白酶体途径由泛素 Ub、泛素激活酶 E1、泛素结合酶 E2、泛素连接酶E3 和 26S 蛋白酶体组成，其对靶蛋白的降解是一个三酶级联反应的过程（如图 1-1）。

所有的泛素结合酶具有的共同特点是把激活的泛素传递给不同的泛素连接酶。酵母和动物的泛素结合酶还具有不同的功能，包括调控细胞周期、DNA 修复以及内质网移位蛋白的降解（Pickart, 2001）。序列分析比对，拟南芥泛素结合酶分为 12 个亚族（Vierstra, 1996）。根据共表达和互作数据，不同的泛素结合酶会选择不同的泛素结合酶互作。AtUBC8 能与大多数泛素连接酶互作，而 AtUBC34 只与特殊的泛素连接酶互作。泛素结合酶变体虽然在序列和结构上与泛素结合酶十分相似，但是缺失具有催化活性的半胱氨酸位点，因此不能与泛素形成硫酯键。进化树分析显示拟南芥含有的 8 个泛素结合酶变体共分为 3 个亚族（Zhang et al., 2007）。1.1.4 泛素连接酶 E3泛素连接酶的催化作用是泛素化过程中酶级联反应中的最后一步。泛素连接酶可以与特定的泛素结合酶和靶蛋白结合，因此该酶是决定靶蛋白的多样性与特异性。在植物界，，泛素连接酶根据其反应机理以及特殊的保守域，共分为三种：HECT（Homology toE6-Associated Carboxy-Terminus）泛素连接酶、RING（Really Interesting New Gene）泛素连接酶和 U-box 泛素连接酶（Duplan and Rivas, 2014）（如图 1-2）。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S512.1

【参考文献】

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1 李杨;李栋;;泛素连接酶-底物选择关系的研究进展[J];生物技术通报;2015年01期

2 陈季武;郑丽娜;王帮正;李晓涛;;泛素化介导的非蛋白质降解功能[J];生物化学与生物物理进展;2012年07期

3 宁约瑟;王国梁;谢旗;;泛素连接酶E3介导的植物干旱胁迫反应[J];植物学报;2011年06期

4 陈科;程汉华;周荣家;;自噬与泛素化蛋白降解途径的分子机制及其功能[J];遗传;2012年01期

5 宋素胜;谢道昕;;泛素蛋白酶体途径及其对植物生长发育的调控[J];植物学通报;2006年05期

6 倪晓光;赵平;;泛素-蛋白酶体途径的组成和功能[J];生理科学进展;2006年03期

本文编号：2661396