黄瓜过氧化氢酶基因CsCAT3的克隆及功能分析

发布时间：2020-05-13 07:04

【摘要】：过氧化氢酶(Catalase,CAT)又称为触酶,是一种重要的末端氧化酶,在许多不同生物对非生物胁迫的耐受过程中起着重要的作用。过氧化氢酶由CAT基因编码,目前已在一系列物种中克隆。黄瓜是葫芦科中的重要蔬菜作物之一,对CAT酶的功能还知之甚少。为了探讨黄瓜过氧化氢酶的功能,以华北型黄瓜9930为实验材料,对黄瓜CAT家族基因进行了生物信息学分析,并采用RT-PCR和荧光定量PCR的方法对黄瓜CAT家族基因进行了组织表达分析和逆境胁迫下的表达量分析。进一步通过RT-PCR的方法克隆了Cs CAT3基因;经过酶切、连接和转化成功构建了p ET32a-CSCAT3表达载体,通过原核表达系统对Cs CAT3基因进行抗逆性功能分析。主要结果如下:1.共鉴定出4个非冗余CAT基因。根据其ID号,分别为命名为Cs CAT1-Cs CAT4。进化分析表明,Cs CAT1和Cs CAT2基因分别归属III和I亚类,另2个基因Cs CAT3和Cs CAT4属于II亚类,它们与拟南芥比水稻和杨树CAT基因的亲缘关系要近。2.Cs CAT基因表达具有明显的组织特异性。对根、茎、叶、花、果等组织的RT-PCR分析表明:Cs CAT1-Cs CAT3在各个组织中都表达,但Cs CAT4在任何组织中都不表达。Cs CAT1与Cs CAT2基因的表达模式相似,在根、叶和果实中都表达量较高。Cs CAT3在茎、叶、花和果实中表达量较高,在根中表达信号较弱。3.采用荧光定量PCR分析表明:不同胁迫处理(热、冷、PEG、Na Cl、H2O2和ABA)下Cs CAT3的表达有不同程度的促进作用。4.采用RT-PCR克隆了Cs CAT3基因,成功构建了原核表达载体,并在BL21中高效表达。Cs CAT3蛋白的分子量为77 KD左右,原核表达分析表p ET-Cs CAT3最佳诱导时间为4 h、IPTG浓度为1 m M、最佳菌液诱导浓度为OD600=0.6,Cs CAT3为可溶性蛋白。5.转化大肠杆菌抗逆性结果表明:Cs CAT3重组蛋白在不同胁迫条件下均能增强原核大肠杆菌的生长能力,Cs CAT3对非生物胁迫具有重要的耐受性。
【图文】：

技术路线图,黄瓜,生长发育,抗性品种

1.3.2 研究意义在调控黄瓜逆境生长发育方面，CsCAT3 是一个新基因，本研究希望通过对该因的生物学功能进行初步研究，来探索黄瓜逆境生长发育的分子机理。本研究是黄CsCAT3 基因在胁迫条件下的表达量出现显著变化的基础上，构建原核表达载体转大肠杆菌 BL21（DE3），，通过分析重组菌的抗冷、热、干旱和耐盐能力，来研究蛋白的功能，在理论上为进一步阐述 CsCAT3 的抗逆机制，在应用上为选育出新的瓜抗性品种奠定基础和指明方向。

亲水,蛋白,亲水性,系数

个蛋白的亲水系数均小于0，说明它们均为亲水性蛋白.707，小于其它三个CAT蛋白，亲水系数最强；CsCAT4亲水于其它3个蛋白，亲水性最弱。从染色体定位分部来看位于4号染色体上，CsCAT3基因位于6号染色体上，而C16（图2-1）。表 2-1 黄瓜 CAT 基因及编码蛋白的基本信息le2-1 Basic information of the CAT genes and encoded proteins in 列号uenc ID基因组DNAlength(bp)预测蛋白（Predictive protein）chrom长度Length(aa)等电点pI分子量MW (KD)亲水系数GRAVY14901 2818 536 6.1 62.07 -0.512 Chr4: 114900 3451 458 6.77 53.41 -0.707 Chr4: 113194 3296 487 6.84 56.11 -0.570 Chr6: 122770 2234 744 5.77 82.79 -0.507 Scaffold
【学位授予单位】：江西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S642.2

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