白蜡虫脂酰辅酶A还原酶基因（EpFAR）的克隆表达与功能研究

发布时间：2020-05-13 15:22

【摘要】：白蜡虫(Ericerus pela Chavanness)是我国特有的一种资源昆虫,由于它能分泌性质优异的虫白蜡,在中国已经被人工养殖上千年,虫蜡主要用于蜡染、蜡烛、刻板模印、中药等行业。虫白蜡是以高级饱和一元酸和高级饱和一元醇所构成的酯类为主要成分。酰基还原途径是生物体内蜡酯合成的主要途径之一,即脂酰辅酶A(fatty acyl-CoA)在脂酰辅酶A还原酶(fatty acyl-CoAreductase,FAR)的作用下还原生成脂肪醇,脂肪醇和脂酰辅酶A在蜡酯合酶(wax synthase,WS)的作用下生成酯。前期研究表明白蜡虫fatty acyl-CoA reductase(EpFAR)基因是与泌蜡密切相关的基因之一,本研究主要采用分子生物学的相关技术方法,首先克隆获得白蜡虫EpFAR基因,明确了白蜡虫EpFAR基因的序列特征,分析该基因在虫体内各组织的转录水平和编码蛋白的表达谱,进一步在培养的昆虫细胞中表达EpFAR蛋白,通过检测EpFAR酶的生物反应产物明确基因EpFAR的功能。获得的主要结果如下:1白蜡虫EpFAR序列特征与系统发育本文在课题组前期研究得到的转录组数据分析基础上,选择其中的脂酰辅酶A还原酶基因序列片段,采用RACE扩增技术,克隆得到了EpFAR基因的3’端和5’端序列,经DNAMAN软件拼接后,上传至NCBI在线比对,与其他生物的脂肪酰辅酶A还原酶基因同源,证明所得的基因为白蜡虫的脂肪酰辅酶A还原酶基因,获得了该基因全长cDNA,命名为EpFAR。基因EpFAR开放阅读框长1569 bp,共编码522个氨基酸,分子量为60.3kDa,该基因具有典型的FAR基因的特征,属于SDR superfamily成员,属于NADB_Rossmann superfamily成员,FAR_C superfamily成员。在其氮端具有特异的FAR-N_SDR_e结构域(22-353aa),NAD_binding_4结构(26-297 aa),以及Extended SDRs所有的典型的辅因子结合基序TGXXGXXG(24-34aa),Classical SDRs所具有的活性位点基序YXXXK(216-220aa),在其碳端具有特异的FAR_C结构域(387-477),Sterile结构(388-479aa)。该基因所具有的保守结构域表明该基因序列较为复杂,可能参与复杂的代谢途径,发挥不同的分子功能。通过MEGA软件构建系统发育树表明,白蜡虫EpFAR与扶桑粉蚧Phenacoccus solenopsis的FAR聚为一枝,与豌豆长管蚜Acyrthosiphon pisum FAR、果蝇Drosophila melanogaster WAT等脂酰辅酶A还原酶较近,这些基因多数参与虫体蜡质物的合成,而与其他昆虫如玉米螟、巢蛾、蝶类、斑螟、蚁类、蜂类以及哺乳类的脂肪酰辅酶A还原酶距离较远,这些基因或者与昆虫性信息素合成相关,或者与醚酯等物质的合成相关。这种关系体现了序列相似性与功能相似性一致的特点。2白蜡虫EpFAR多克隆抗体为了研究基因EpFAR的功能和表达特征,选择EpFAR的一段特异性强的多肽序列作为抗原区,合成制备抗原肽,并与载体蛋白匙孔血蓝蛋白偶联,多次免疫新西兰大白兔,获得高效价的抗血清。经过抗血清的亲和纯化,成功制备了白蜡虫脂肪酰辅酶A还原酶多克隆抗体。所得抗体效价为5.12×10~5,具有较高的免疫原性和较高的纯度,抗体的浓度达0.7 mg/ml,可以满足后续实验需求。3白蜡虫EpFAR基因转录水平与蛋白表达谱、亚细胞定位以实时定量PCR技术进行的表达量测定结果显示,在雄性白蜡虫二龄泌蜡高峰期,基因EpFAR的转录主要在白蜡虫的表皮组织中发生,而在脂肪体、马氏管、消化道以及精巢中的mRNA转录水平相对低,在消化道中的转录水平最低,表皮中的转录水平与其他组织中的转录水平差异显著,提示EpFAR转录的发生可能与表皮中蜡腺的生理代谢相关。以免疫荧光技术测定EpFAR蛋白的表达谱,结果显示,在雄性白蜡虫二龄泌蜡高峰期,EpFAR蛋白主要在白蜡虫表皮蜡腺和精巢中表达,在其他组织部位检测不到红色荧光,提示该蛋白的表达可能与蜡腺和精巢的生理代谢相关,或者受到特定基因的调控。利用在线分析工具PSORT和Euk-mPLoc 2.0分析EpFAR蛋白的亚细胞定位显示,EpFAR蛋白定位于细胞质。免疫荧光技术检测EpFAR蛋白定位结果与预测结果一致。4白蜡虫EpFAR在昆虫细胞中的表达与功能为了在昆虫细胞中表达基因EpFAR,本研究选择昆虫杆状病毒表达系统中pFastBac HT B作为表达载体,利用PCR技术将基因EpFAR的开放阅读框ORF序列与表达载体序列相联,酶切分析、测序分析表明成功获得了重组表达载体pFastBac HT-FAR。以重组表达载体质粒转化该载体宿主菌获得重组的杆粒,PCR鉴定表明所得杆粒包含目标基因的ORF序列。以所得杆粒转染昆虫细胞,蛋白电泳和免疫荧光技术表明成功获得了重组的杆状病毒,基因EpFAR在昆虫细胞中成功表达。经过扩增后的病毒感染昆虫细胞,实现目标基因的大量表达。收获昆虫细胞并提取蛋白用于酶活性与功能分析实验。GC-MS检测结果表明,所表达的白蜡虫EpFAR在本实验条件下具有生物活性,能将特定的底物二十六酰辅酶A(26:0-CoA)还原生成相应的脂肪醇26:0-OH。进一步研究其反应的条件表明,所表达的白蜡虫EpFAR需要NADPH作为酶反应的辅因子,而NADH存在与否并不影响EpFAR的活性与功能;所得EpFAR酶液在25℃至40℃范围内均具有还原活性;与其他缓冲系统相比,当pH值为6.4时,在该反应系统中酶的活性受到一定程度的抑制,GC-MS检测未能识别到相应于所添加底物的脂肪醇;在三种不同链长的底物存在时,与二十四酰辅酶A(24:0-CoA)和二十二酰辅酶A(22:0-CoA)相比,EpFAR酶优先选择26:0-CoA作为酶反应的底物,生成26:0-OH。可见,白蜡虫EpFAR具有脂肪酰辅酶A还原酶家族基因所具有的还原特性,并且具有生成醇的能力,该反应与蜡酯合成途径的酰基还原途径相一致,酰基辅酶A受酰基辅酶A还原酶催化,在辅因子NADPH作用下,形成主要醇,用于蜡酯生物合成。
【图文】：

长链酰基,植物表皮,辅酶A,酰基载体蛋白

4图1 植物表皮长链酰基辅酶A的合成。FAS，脂肪酸合成酶复合体；β-酮酰酰基载体蛋白合成酶；ACP，酰基载体蛋白；FAT，脂肪酰酰基载体蛋白硫解酶；LACS，长链酰基辅酶A合成酶。Figure 1 Biosynthesis process of long-chain acyl-CoA in plants cuticular layer. FAS, fatty acidsynthase complex；KAS, β-ketoacyl ACP synthase；ACP, acyl-carrier-protein；FAT, fatty acyl-ACP thioesterase；LACS, long-chain acyl-CoA synthase.在拟南芥等植物中，C16和C18脂肪酸碳链延长受与内质网相联的被称为脂肪酸延长酶的多酶系统（fatty acyl-CoA elongase system）的催化，在质体中饱和的十六碳或十八碳脂酰辅酶A延长，产生20-34个碳原子的超长链脂肪酸（very long chain fattyacids,VLCFAs）

代谢途径,酰基辅酶A,脱羰,酰基转移酶

[47]。植物体表皮蜡的代谢途径主要存在四种情况（如图2），酰基辅酶A前体在酰基辅图2 生物表皮蜡酯代谢途径（Kolattukudy, P.E., 1996；Samuels L, Kunst L, Jetter R,,2008）.①酰基辅酶A硫酯酶；②脂酰辅酶还原酶；③醛脱羰酶；④中链烷烃羟化酶；⑤蜡质合成酶/甘油二酯酰基转移酶Figure 2 Proposed biosynthesis pathway of cuticular wax in organisms（Refer to Kolattukudy,P.E., 1996；Samuels L, Kunst L, Jetter R ，2008）. ①Acyl-CoA thioesterase，ACOT；②Fattyacyl-CoA reductase，FAR；③Aldehyde decarbonylase；④mid-chain alkane hydroxylase，，MAH1；⑤Wax ester synthase/diacylglycerol acyltransferase
【学位授予单位】：南京林业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S899.1

【参考文献】