建立黄瓜遗传转化和基因编辑技术体系以创制黄瓜全雌系种质材料

发布时间：2020-05-13 16:21

【摘要】：全雌系在黄瓜育种中应用,不仅可以增产,还可以免去杂交制种过程中对亲本去雄的步骤,省时省力。目前主要通过杂交的方式导入全雌基因,不仅育种周期长,费时费力,而且还容易产生连锁累赘引入不良基因,增加育种风险。利用CRISPR/Cas9定点基因编辑技术创制全雌系可以避免上述缺点。然而葫芦科转基因一直是世界范围内的研究难题,遗传转化体系地缺乏极大地滞后了CRISPR/Cas9基因编辑技术在葫芦科植物中的应用。本研究利用原位杂交检测了黄瓜子叶多芽发生再生体系中再生基因CsSTM的表达,结合切片分析我们发现再生芽起源于子叶U 口附近的上表皮细胞,并且再生位点在U 口的深处。利用35S:GFP作为报告基因监测侵染过程,我们发现在侵染时施加真空负压可以加强农杆菌的侵染使之达到U 口深处,而采用普通浸泡的方法则只能侵染U 口的表层细胞。我们于是通过真空负压法加强侵染并最终成功获得了再生荧光芽。另外,在培养基中添加CO的供体Hemin,可以促进生根并降低转基因苗的死亡率。通过同样的策略,我们也成功获得了甜瓜转基因植株。进一步通过选用黄瓜内源的CsU6启动子和插入GFP独立表达框,我们也对CRISPR/Cas9载体系统进行了优化。我们针对黄瓜三个基因的CsVFFB1,CsMLO8和CsGAD1进行基因编辑,数据统计表明遗传转化的效率接近1 ‰;TO植株基因编辑效率为100%,远远高于之前报道的20%。甜瓜中的控制全雌基因性状的基因为CmWIP1,其编码一个控制性别发育的转录因子。黄瓜中其同源基因CsWIP1功能未见报道。我们通过基因编辑敲除CsWIP1,并利用荧光辅助筛选在转基因后代中获得了 transgene-free的纯合突变体Cswip1。Cswip1突变导致雌雄同株转变为全雌株,雌花率提高了 7倍。Cswip1雌花的果实与野生型并无明显差异,在黄瓜育种上有巨大的潜在应用价值。本研究建立了一套简单高效的黄瓜和甜瓜遗传转化体系。通过优化CRISPR/Cas9载体系统提高了黄瓜中基因编辑的效率,并最终通过基因编辑CsWIP1创制了黄瓜全雌系种质材料。
【图文】：

我们选用经典的以子叶为外植体诱导多芽发生的再生体系进行遗传转化实逡逑验（Ｇａｌ－Ｏｎ邋ｅｔａｌ．，２００５），并采用传统浸泡侵染的方法进行农杆菌侵染。取刚萌发逡逑的种子，按如图３．１邋Ａ所示准备外植体，将外植体浸泡在农杆菌悬浮液中１０邋ｍｉｎ逡逑１９逡逑

完成侵染（图３．１邋Ｂ）。共培养三天后，在荧光体式显微镜下观察到外植体Ｕ邋口处逡逑有少量荧光（图３．１邋Ｃ），表明农杆菌的侵染强度较弱。清洗掉农杆菌后，将外植逡逑体转移到再生培养基上再生。三周后，发现大部分外植体均可再生形成芽（图３．１逡逑Ｄ），表明该再生体系再生效率较高。然后在荧光显微镜下观察时，，却发现所得再逡逑生芽全部都为ＧＦＰ阴性。部分外植体产生ＧＦＰ阳性愈伤（图３．１邋Ｅ和Ｆ），但分逡逑离这些愈伤继续培养无法获得再生植株。采用该方法经大量实验均未获得ＧＦＰ逡逑阳性转基因植株。逡逑３．１．２再生位点在Ｕ邋口深处逡逑通过遗传转化获得转基因植株的过程可以分为侵染和再生两个过程，首先逡逑农杆菌侵染外植体的部分细胞，然后被侵染的细胞经过分裂和分化再生为植株。逡逑在上述实验中，ＧＦＰ活体监测的结果显示一定比例的外植体包含ＧＦＰ荧光愈伤，逡逑表明农杆菌可以完成对外植体的侵染过程。子叶外植体经三周的再生过程产生了逡逑大量再生芽
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士后
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S642.2

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本文编号：2662216